Πριν από μια δεκαετία περίπου προσδιορίστηκε ότι το γονίδιο SRY,το οποίο χαρτογραφήθηκε κοντά στο άκρο του μικρού σκέλους του χρωμοσώματος Υ,αποτελεί τον ορχεοκαθοριστικό παράγοντα των θηλαστικών (Τestis Determining Factor-TDF), δηλαδή,τον ‘κύριο διακόπτη’ που πυροδοτεί μια αλληλουχία γεγονότων που οδηγούν τελικά στην εμφάνιση του αρσενικού φύλου.Από τότε,έχουν βρεθεί πολλά ακόμη γονίδια απαραίτητα για την πρώιμη ανάπτυξη των γονάδων,τόσο στα θηλαστικά όσο και σε άλλες τάξεις σπονδυλωτών.

Τα μοριακά μονοπάτια που οδηγούν από την αδιαφοροποίητη γονάδα στο σχηματισμό του όρχι ή της ωοθήκης δεν έχουν γίνει ακόμη εντελώς κατανοητά.Οι προσπάθειες των επιστημόνων επικεντρώνονται στο να μπορέσουν να διαπιστώσουν με ποιόν τρόπο ταιριάζουν ή δεν ταιριάζουν μεταξύ τους τα διάφορα κομμάτια αυτού του πολύπλοκου παζλ που έχουν συγκεντρωθεί τα τελευταία 10 έτη.Από τις έρευνες που έχουν διεξαχθεί,προκύπτουν δύο βασικά συμπεράσματα:Το ένα είναι ότι τα ίδια βασικά σετ γονιδίων φαίνεται να ενεργοποιούνται σε όλες τις τάξεις των σπονδυλωτών,παρά τις διαφορές που παρατηρούνται στους μηχανισμούς.Το άλλο είναι ότι ο καθορισμός του φύλου στα σπονδυλωτά είναι το αποτέλεσμα ενός πολύπλοκου δικτύου από ρυθμιστικές αλληλεπιδράσεις και όχι μια απλή ιεραρχική αλληλουχία δράσης ορισμένων γονιδίων.Έτσι,η ανάπτυξη του όρχι είναι δυνατή μόνο μέσω της αλληλεπίδρασης του γονιδίου SRY με άλλα γονίδια τα οποία ανήκουν σε αυτοσωμικά χρωμοσώματα.Από αυτά,άλλα εμπλέκονται στη ρύθμιση της έκφρασης του SRY και άλλα αποτελούν στόχους του γονιδίου SRY.

Ωστόσο πολλά ερωτήματα παραμένουν αναπάντητα.Δύο από αυτά είναι τα εξής: Ποιά είναι τα γονίδια-στόχοι του SRY και ποιά η φύση τους,δηλαδή,αν εμπλέκονται στην ανάπτυξη του όρχι ή στην καταστολή της ανάπτυξης της ωοθήκης ή και στα δύο.Ποιά είναι τα γονίδια (αν υπάρχουν) που οδηγούν στη διαμόρφωση της ωοθήκης.

Πριν από τον καθορισμό του φύλου,σχηματίζεται η γονάδα των θηλαστικών.Αυτή έχει τη μορφή μιας καταβολής που δύναται να διαφοροποιηθεί είτε σε όρχεις είτε σε ωοθήκες ανάλογα με την παρουσία ή όχι του χρωμοσώματος Υ.Έχουν προσδιοριστεί διάφορα γονίδια με καθοριστική συμβολή στο σχηματισμό ή στην επιβίωση της γοναδικής καταβολής.Σε αυτά συμπεριλαμβάνονται οι μεταγραφικοί παράγοντες Wt1,SF1,Emx2,Lim1 και Lhx9.

Οι γοναδικές καταβολές, ίδιες μορφολογικά και στα δύο φύλα,αναπτύσσονται στη μία και στην άλλη πλευρά του ραχιαίου μεσεντερίου,στην επιφάνεια του μεσονέφρου και σε στενή σχέση με αυτόν. Η γοναδική καταβολή εμφανίζεται αρχικά σαν πάχυνση του εσωτερικού τοιχώματος του μεσονέφρου. Καθώς αναπτύσσεται,προβάλλει μέσα στο σπλαχνικό κοίλωμα και χωρίζεται βαθμιαία από το μεσόνεφρο,με τον οποίο ωστόσο παραμένει συνδεδεμένη στην περιοχή της πύλης με το μεσόρχιο για τον όρχι και το μεσοωοθήκιο για την ωοθήκη.

Κατά την ανάπτυξη των γονάδων στον άνθρωπο και στα περισσότερα θηλαστικά διακρίνονται τρία στάδια: Το προ-γοναδικό,το αδιαφοροποίητο και το στάδιο πρωτογενούς φυλετικής διαφοροποίησης. Στα δύο πρώτα στάδια η μελλοντική εξέλιξη των γονάδων σε όρχι ή σε ωοθήκη δεν προδιαγράφεται ιστολογικά,αλλά έχει προκαθοριστεί κατά τη γονιμοποίηση.

Παρουσία του χρωμοσώματος Υ, η διαφοροποίηση της γονάδας σε όρχι είναι ένα ταχύ φαινόμενο,σε αντίθεση με την αργή και καθυστερημένη ανάπτυξη της ωοθήκης σε ένα ΧΧ άτομο. Συγκεκριμένα,στο ανθρώπινο έμβρυο η διαφοροποίηση του όρχι αναγνωρίζεται όταν το έμβρυο έχει μήκος 14-16mm, δηλαδή από την 43η μέρα της εμβρυϊκής ηλικίας,ενώ οι πρώτες εικόνες μειωτικής πρόφασης δε φαίνονται μέσα στην ωοθήκη, παρά στο στάδιο των 74mm.

Στον αρουραίο η ωοθήκη αναγνωρίζεται με μορφολογικά κριτήρια τη 16η μέρα μετά τη γονιμοποίηση. Σε ορισμένα είδη τα σωματικά κύτταρα οργανώνονται σε ‘χορδές’,ανάλογες των σπερματικών χορδών που παρατηρούνται στο αρσενικό. Όταν υπάρχουν χορδές διαιρούν την ωοθήκη σε δύο διαφορετικά διαμερίσματα:ένα επιθηλιακό που περιέχει και τα βλαστικά γεννητικά κύτταρα και ένα μεσεγχυματικό διαμέρισμα εξωτερικά. Τα δύο διαμερίσματα χωρίζονται από μία βασική μεμβράνη.Δεν υπάρχουν αρκετά στοιχεία όσον αφορά την κινητική σχηματισμού της βασικής μεμβράνης,τη διατήρηση της και την εξέλιξή της κατά την οριστική ωοθηκική ιστογένεση. Ιστοχημικά δεδομένα αποδεικνύουν ότι στις 13,5 ημέρες στις γοναδικές καταβολές και στα δύο φύλα εκφράζονται οι γλυκοπρωτεϊνες φιμπρονεκτίνη και λαμινίνη της βασικής μεμβράνης και κατανέμονται ως λεπτά ινίδια ομοιόμορφα μεταξύ των αδιαφοροποίητων κυττάρων του γοναδικού βλαστήματος.Δεν υπάρχουν εμφανείς επιθηλιακές δομές ούτε συνεχής βασική μεμβράνη. Τα δύο αντιγόνα κατανέμονται σε ένα ασυνεχές γραμμικό πρότυπο κάτω από το κοιλωματικό επιθήλιο που καλύπτει τη γονάδα.

Σε γονάδες εμβρύων 14 ημερών και στα δύο φύλα παρατηρούνται επιθηλιακές χορδές που περιέχουν τα βλαστικά γεννητικά κύτταρα. Η φιμπρονεκτίνη εντοπίζεται στη συνεχή βασική μεμβράνη των σπερματικών χορδών στο αρσενικό ενώ στο θηλυκό κατανέμεται γύρω από τα κύτταρα του μεσεγχυματικού διαμερίσματος που περιβάλλουν τις επιθηλιακές χορδές και τις ομάδες των ωογονίων. Η λαμινίνη δεν ανιχνεύεται στο μεσέγχυμα,εντοπίζεται μόνο στη βασική μεμβράνη των σπερματικών χορδών και στην περιφέρεια του επιθηλιακού διαμερίσματος στο θηλυκό.Το εσωτερικό των επιθηλιακών χορδών είναι αρνητικό για τα δύο αντιγόνα και στα δύο φύλα.

Τα σωματικά κύτταρα της ωοθήκης συνεχίζουν να πολλαπλασιάζονται κατά την εμβρυϊκή περίοδο και βαθμιαία περιβάλλουν μεμονωμένα τα ωοκύτταρα και σχηματίζουν τα αρχέγονα ωοθυλάκια. Κάθε αρχέγονο ωοθυλάκιο αποτελείται από ένα ωοκύτταρο περιβαλλόμενο από μια σειρά αποπλατυσμένων σωματικών κυττάρων,που λέγονται και ‘προκοκκιώδη κύτταρα’. Συνεχής βασική μεμβράνη διαχωρίζει τα προκοκκιώδη κύτταρα από τον συνδετικό ιστό.Ο χρόνος εμφάνισης των πρώτων αρχέγονων ωοθυλακίων ποικίλλει στα διάφορα είδη και στον άνθρωπο αντιστοιχεί σε 4,5 μήνες μετά τη γονιμοποίηση.

Στον άνθρωπο μεταξύ της 7ης και 9ης εβδομάδας μεγάλα αμοιβαδοειδή αρχέγονα γεννητικά κύτταρα αναγνωρίζονται μέσα στη γοναδική καταβολή και αποτελούν το 8-10% των ωοθηκικών κυττάρων. Τα περισσότερα είναι ωογόνια και διαιρούνται με μίτωση. Η πρόφαση της πρώτης μειωτικής διαίρεσης αρχίζει στο ανθρώπινο έμβρυο ΧΧ στο τέλος του πρώτου τριμήνου της κύησης και εφεξής όλο και περισσότερα βλαστικά γεννητικά κύτταρα αναγνωρίζονται στα στάδια της λεπτοταινίας,ζυγοταινίας και παχυταινίας της πρόφασης,της πρώτης μειωτικής διαίρεσης.Το στάδιο της διπλοταινίας της πρόφασης συμπληρώνεται αμέσως μετά τη γέννηση και το ωοκύτταρο παραμένει σε φάση ανάπαυσης μέχρι την ήβη. Η αναστολή της μειωτικής διεργασίας εξαρτάται από το θυλακικό περιβάλλον και τα σωματικά κύτταρα παίζουν σημαντικό ρόλο σ’αυτήν. Η ανάπτυξη των ωοθυλακίων αρχίζει μεταξύ της 16ης και της 21ης εβδομάδας της κύησης.Τα πρώτα αρχέγονα ωοθυλάκια παρατηρούνται στην ωοθήκη την 21η εβδομάδα και νέα συνεχίζουν να αναπτύσσονται μέχρι την 31η εβδομάδα. Η ωρίμανση των αρχέγονων ωοθυλακίων, κατά την οποία τα θυλακικά κύτταρα αποκτούν κυβοειδές σχήμα και αρχίζουν να διαιρούνται, παρατηρείται επίσης αυτήν την περίοδο ενώ συγχρόνως μια διαφανής άλως ,η ‘διαφανής ζώνη’, διακρίνεται γύρω από το ωοκύτταρο.Πολύστιβα ωοθυλάκια με ωοκύτταρο, διαφανή ζώνη,πολλές στιβάδες κοκκιωδών κυττάρων και θήκη που προέρχεται από το στρώμα αναγνωρίζονται κατά τον 6ο μήνα της κύησης,στο όριο φλοιού και μυελού της ωοθήκης. Ώριμα ή ωοθυλάκια του Graaf με εντελώς αναπτυγμένο ωοκύτταρο,άντρο γεμάτο από θυλακικό υγρό,πολλές στιβάδες κοκκιωδών κυττάρων και θήκη διακρίνονται λίγο πριν από το τέλος της κύησης και στο θήλυ νεογνό.Συχνά στην εμβρυϊκή ωοθήκη παρατηρούνται ωοθυλάκια με περισσότερα από ένα ωοκύτταρα,φαινόμενο σπάνιο στην ωοθήκη της ώριμης γυναίκας.

Ο ρόλος των φυλετικών χρωμοσωμάτων στη διαφοροποίηση της ωοθήκης παραμένει υποθετικός.Η απενεργοποίηση ενός από τα δύο χρωμοσώματα Χ στα σωματικά 46,ΧΧ κύτταρα συμβαίνει σε ένα πολύ πρώιμο στάδιο της εμβρυογένεσης.Στα ωοκύτταρα και τα δύο φυλετικά χρωμοσώματα παραμένουν λειτουργικά. Ακόμη, υπάρχουν διαφωνίες για το εαν και τα δύο Χ χρωμοσώματα είναι απαραίτητα για τη διαφοροποίηση της ωοθήκης.Η φυσιολογική Μείωση σε θηλυκά έμβρυα 45,Χ έχει περιγραφεί και η εξαφάνιση των βλαστικών κυττάρων από αυτές τις ωοθήκες είναι ένα ύστερο φαινόμενο που συμβαίνει μετά τη 12η βδομάδα της εμβρυϊκής ζωής.Ο θάνατος των βλαστικών κυττάρων επιφέρει την απόπτωση του θυλακίου και την απώλεια της ενδοκρινικής δραστηριότητας της ωοθήκης,η οποία αντικαθίσταται από ινώδη ιστό ή από μια ραβδωτή διαμόρφωση.

Όπως προαναφέρθηκε,στα θηλαστικά η αδιαφοροποίητη γονάδα μετατρέπεται σε όρχι ή σε ωοθήκη ανάλογα με το αν εκφράζεται το γονίδιο SRY.Η έκφραση του SRY προκαλεί μορφογενετικές αλλαγές στη γονάδα που καταλήγουν στην τυπική δομή του όρχι.Αυτό συμβαίνει στα ποντίκια 11,5-12,5 ημέρες μετά τη σύλληψη. Απουσία του γονιδίου Sry τα βλαστικά κύτταρα μπαίνουν στη Μείωση στις 13,5 ημέρες μετά τη σύλληψη και παίζουν πολύ σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση του ωοθυλακίου.Υπάρχουν δεδομένα που υποδεικνύουν ότι η διαφοροποίηση της ωοθήκης δε γίνεται παθητικά κατά την απουσία του SRY.Χαρακτηριστικό είναι ότι στην αναπτυσσόμενη ωοθήκη έχουμε μεταβολές στην έκφραση διαφόρων γονιδίων.Για παράδειγμα,η έκφραση του γονιδίου Sox9 ελαττώνεται στην αναπτυσσόμενη ωοθήκη σε σχέση με την έκφρασή του στη γοναδική ακρολοφία.Επιπλέον,η μη παθητική ανάπτυξη της ωοθήκης στηρίζεται από την ταυτοποίηση ατόμων με φυσιολογικό καρυότυπο 46,ΧΥ που ενώ φέρουν το γονίδιο SRY,εντούτοις εμφανίζουν αντιστροφή του φύλου,δηλαδή,θηλυκό φαινότυπο. Άρα,θα πρέπει να υπάρχει κάποιο γονίδιο το οποίο να οδηγεί σε θηλυκό φαινότυπο είτε αναστέλλοντας την ανάπτυξη του όρχι είτε ενεργοποιώντας την ανάπτυξη της ωοθήκης.

Η αντιστροφή του φύλου από αρσενικό σε θηλυκό,παρατηρήθηκε σε άτομα με διπλασιασμούς στο μικρό σκέλος του χρωμοσώματος Χ,με αποτέλεσμα να διαθέτουν δύο ενεργά αντίγραφα ενός τμήματος του χρωμοσώματος αυτού.Το μικρότερο τμήμα του Χ χρωμοσώματος που πρέπει να διπλασιαστεί για να προκληθεί αντιστροφή του φύλου ονομάστηκε DSS (Dosage Sensitive Sex reversal) και χαρτογραφήθηκε σε ένα γενετικό τόπο 160kb του Χρ21.Η ταυτοποίηση αρσενικών ατόμων που παρουσιάζουν διαγραφές στο τμήμα DSS,υποδεικνύει ότι αυτός ο γενετικός τόπος δεν είναι απαραίτητος για τη διαφοροποίηση του όρχι.Αυτό που υποθέτουμε είναι ότι το τμήμα DSS παίζει ρόλο στην ανάπτυξη της ωοθήκης ή λειτουργεί ως σύνδεσμος μεταξύ του σχηματισμού του όρχι και της ωοθήκης.

Χαρακτηριστικά αναφέρονται δύο παραδείγματα ασθενών από οικογένειες με διπλασιασμούς στο μικρό σκέλος του χρωμοσώματος Χ: Η πρώτη περίπτωση ήταν μια από δύο αδερφές με καρυότυπο 46,ΧΥ,der(22),t(X;22)(p11.3;p11) και σαφή θηλυκά γεννητικά όργανα.Η γυναίκα αυτή επέζησε αλλά σταδιακά παρουσίασε νοητική καθυστέρηση και πολλά δυσμορφικά χαρακτηριστικά.Η δεύτερη περίπτωση ήταν ένα αγόρι,το οποίο κληρονόμησε άμεσα από τη μητέρα του ένα διπλασιασμό του Χp21.3-pter με το σημείο θραύσης κοντά στο γενετικό τόπο του DSS.Παρουσίαζε πολλαπλές ανωμαλίες και μικρό φαλλό αλλά κατά τα άλλα σαφή αρσενικά γεννητικά όργανα.Με αποτύπωση κατά Southern και χρησιμοποιώντας ανιχνευτές από Xp22.13 ως p21.2 καθορίστηκε η διπλασιασμένη περιοχή.Κλινικά, κυτταρογενετικά και μοριακά δεδομένα και από τους δύο ασθενείς συγκρίθηκαν με εκείνα προηγούμενων σχετικών περιπτώσεων.Μία σύγκριση των εξωγενετικών συμπτωμάτων,αποκάλυψε ότι δεν υπήρχαν διαφορές ανάμεσα στους ασθενείς με ή χωρίς αντιστροφή φύλου.Και στις δύο περιπτώσεις τα συμπτώματα δεν ήταν συγκεκριμένα.Μεταξύ 22 ασθενών με διπλασιασμό στο Χρ,οι 9 είχαν σαφή θηλυκά γεννητικά όργανα κι έναν σαφώς προσδιορισμένο διπλασιασμό του τμήματος DSS. Άλλοι 2 με διπλασιασμό του DSS εμφάνιζαν ασαφή εξωτερικά γεννητικά όργανα.Από αυτά τα δεδομένα συμπεραίνουμε ότι μπορεί να άρχισε η επαγωγή του ορχικού ιστού σ’αυτούς τους ασθενείς ,αλλά ο τύπος των γεννητικών τους οργάνων εξαρτήθηκε από το βαθμό του μεταγενέστερου εκφυλισμού εξαιτίας κάποιου γονιδίου στο τμήμα DSS.

Η ταυτοποίηση των ΧΥ θηλυκών με διπλασιασμό σε μια περιοχή του Χρ οδήγησε,επομένως,στην υπόθεση ότι η διπλή δόση ενός γονιδίου που βρίσκεται στη διπλασιασμένη περιοχή προκαλεί την αντιστροφή του φύλου.Ένα γονίδιο που απομονώθηκε από αυτή την περιοχή,το οποίο ονομάστηκε DAX-1,κωδικοποιεί για ένα νέο μέλος της υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων ορμονών.Σε έρευνες που έγιναν σε χοίρους βρέθηκε ότι το γονίδιο Dax-1 (αντίστοιχο με το ανθρώπινο DAX-1) εκφράζεται στα επινεφρίδια,στο βλεννογόνο αδένα και στις γονάδες,σε διάφορα στάδια της διαφοροποίησης.Στις γονάδες,η έκφραση ξεκινά μεταξύ της 21ης και της 23ης μέρας μετά τη σύλληψη,τόσο στις ΧΧ όσο και στις ΧΥ ουρογεννητικές ακρολοφίες και συνεχίζεται μέχρι την ενήλικη ζωή. Η έκφραση σε αυτούς τους ιστούς υποδεικνύει την εμπλοκή του Dax-1 στην ανάπτυξη και τη λειτουργία του αναπαραγωγικού συστήματος σε πολλαπλά επίπεδα.

ΤΟ ΓΟΝΙΔΙΟ DΑΧ-1

To σύνδρομο αντιστροφής του φύλου (dosage-sensitive sex reversal) είναι μια γενετική ασθένεια όπου τα προσβεβλημένα άτομα ενώ έχουν φυσιολογικό καρυότυπο 46,ΧΥ και διαθέτουν το γονίδιο SRY,εντούτοις παρουσιάζουν θηλυκό φαινότυπο.Το σύνδρομο αυτό προκαλείται από το διπλασιασμό μιας μικρής περιοχής του χρωμοσώματος Χρ21 που ονομάστηκε DSS.Στο τμήμα αυτό του μικρού σκέλους του χρωμοσώματος Χ έχουν χαρτογραφηθεί διάφορα γονίδια,που εως πρόσφατα ήταν υποψήφια για την εμφάνιση αντιστροφής του φύλου από αρσενικό σε θηλυκό,σε περίπτωση διπλασιασμού τους. Μερικά από αυτά είναι τα γονίδια DAM, το γονίδιο MAGE-Xp καθώς και το γονίδιο DAX-1. Τα αποτελέσματα των τελευταίων ερευνών δείχνουν ότι η ύπαρξη δύο ενεργών αντιγράφων του DAX-1 είναι αυτή που,τελικά,προκαλεί την αντιστροφή του φύλου σε θηλυκό.

Το γονίδιο DAX-1 (Dosage-sensitive sex reversal, Adrenal hypoplasia congenita (AHC), critical region on the X chromosome,gene 1), είναι υπεύθυνο για τη σύνθεση ενός ασυνήθιστου μέλους της υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων ορμονών.Υπάρχουν ενδείξεις ότι το γονίδιο αυτό παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στον καθορισμό του φύλου αλλά και στη διαφοροποίηση της γονάδας.

Για να καθοριστεί εαν το Dax-1 μπορεί να δώσει φαινότυπο με αντιστροφή του φύλου σε ποντίκια,ισοδύναμο με αυτόν που αναπτύσσεται σε άτομα με διπλασιασμό της DSS περιοχής,δημιουργήθηκαν διαγονιδιακά ποντίκια τα οποία έφεραν επιπλέον αντίγραφα του γονιδίου Dax-1.Για να γίνει αυτό,το cDNA του Dax-1 μαζί με ιντρόνια από την β-σφαιρίνη κουνελιού και σήμα πολυαδενυλίωσης εισήχθησαν σε μια περιοχή που βρίσκεται μετά από ενα τμήμα 11kb, το οποίο αποτελεί ειδικό ρυθμιστικό παράγοντα του Dax-1 στη γοναδική ακρολοφία.Έτσι πήραμε το συνδυασμό Dax:Dax.Σε σύνολο 15 διαγονιδιακών ποντικιών που γεννήθηκαν ζωντανά (Fο),τα 10 ήταν αρσενικά και τα 5 θηλυκά.Όλα τα αρσενικά ήταν ΧΥ και όλα τα θηλυκά ήταν ΧΧ.Εννέα από τα ΧΥ αρσενικά και όλα τα ΧΧ θηλυκά μετέφεραν το ανασυνδυασμένο μόριο DNA στους απογόνους τους.Καμία αντιστροφή του φύλου δεν παρατηρήθηκε μεταξύ αυτών των ποντικιών της F1 γενιάς αλλά ούτε και στους απογόνους τους. Επιπλέον, 13 διαγονιδιακά έμβρυα της γενιάς Fo που προέκυψαν απευθείας από μικροέγχυση, αναλύθηκαν από τη 14,5 εως τη 16,5 ημέρα της κύησης.Παρατηρήθηκαν 7 φαινοτυπικά φυσιολογικά ΧΥ αρσενικά και 6 φυσιολογικά ΧΧ θηλυκά.

Εκτός από την εκδοχή το Dax-1 να μην είναι υπεύθυνο για την αντιστροφή του φύλου,υπάρχουν και κάποιες άλλες αιτίες στις οποίες μπορεί να οφείλεται το ότι το ανασυνδυασμένο μόριο DNA δεν έδωσε αντιστροφή του φύλου και θηλυκό φαινότυπο στα ποντίκια.Η πιο προφανής είναι ότι τα επίπεδα της έκφρασης του ήταν ανεπαρκή ώστε να επιτευχθεί μια διπλή δόση δράσης του DΑΧ-1.Τα σχετικά ποσά της έκφρασης του ενδογενούς και του επιπρόσθετου γονιδίου Dax-1 στις ουρογενετικές ακρολοφίες, στις 11,5 ημέρες της κύησης ,καθορίστηκαν με τη μέθοδο RNase protection analysis (εικόνα 4). Παρατηρήθηκε ένα μεγάλο εύρος στα επίπεδα έκφρασης του επιπρόσθετου γονιδίου Dax-1.Πολλά ζώα είχαν πολύ χαμηλά επίπεδα,αλλά τέσσερις γραμμές από τις δέκα που αναλύθηκαν εκφράστηκαν σε επίπεδα υψηλότερα από το ενδογενές γονίδιο,με τη γραμμή 1812 να παρουσιάζει τη μεγαλύτερη έκφραση (5 φορές υψηλότερη από το φυσιολογικό επίπεδο). Με τη μέθοδο της αποτύπωσης κατά Western,όπου χρησιμοποιήθηκε ένα μονοκλωνικό αντίσωμα για το DΑΧ-1,πρωτεϊνες προερχόμενες από τις ουρογενετικές ακρολοφίες των 11,5 ημερών της εμβρυϊκής ζωής,από τις γραμμές 1812 και 1979,επιβεβαίωσαν ότι υπήρχε παράλληλη αύξηση στα επίπεδα της πρωτεϊνης του Dax-1.Τα αποτελέσματα αυτά έδειξαν ότι τουλάχιστον κάποια από τα Dax1:Dax1 διαγονιδιακά ζώα είχαν συνολικά επίπεδα έκφρασης του Dax-1 τα οποία ήταν σημαντικά υψηλότερα από τη διπλή δόση που αναμένεται σε ασθενείς με Χρ21 διπλασιασμούς.

Το να βασιστούμε μόνο στο φυλετικό φαινότυπο των ενηλίκων μπορεί να είναι παραπλανητικό ,αφού οι ορχι-ωοθήκες μπορούν να αναχθούν, κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης, είτε σε ωοθήκες είτε σε όρχεις και συνήθως στο δεύτερο.Επομένως,παρατηρήθηκαν τα εμβρυϊκά στάδια ενός αριθμού διαγονιδιακών γραμμών Dax:Dax. Ο σχηματισμός των ορχικών χορδών και η έκφραση του Amh, βρέθηκαν να είναι σημαντικά καθυστερημένα στη γραμμή 1812, η οποία εκφράζει τα υψηλότερα επίπεδα του επιπρόσθετου Dax-1 (εικόνα 5α), αλλά και τα δύο χαρακτηριστικά διορθώθηκαν στις 13,5 ημέρες της κύησης.Έντονες επιδράσεις δεν παρατηρήθηκαν στις γραμμές που είχαν χαμηλότερη έκφραση του επιπρόσθετου Dax-1,αν και οι ορχικές χορδές βρέθηκαν να μην είναι οργανωμένες στα ΧΥ έμβρυα της γραμμής 2182 (εικόνα 5.α)

Για να αυξηθεί ακόμη περισσότερο το επίπεδο έκφρασης του Dax-1,ημιζυγώτες από τη διαγονιδιακή γραμμή 1812 διασταυρώθηκαν μεταξύ τους έτσι ώστε να δώσουν ομοζυγώτες.Τα ΧΥ ζώα αναπτύχθηκαν ως αρσενικά αλλά και οι τρεις ενήλικοι που εξετάστηκαν ήταν στείροι.Οι όρχεις των ομοζυγωτών ήταν μικροί σε σχέση με τα φυσιολογικά αρσενικά (πχ μερικοί όρχεις ήταν 31 mg σε σύγκριση με έναν φυσιολογικό όρχι που ζυγίζει 80 mg) και τμήματα αποκάλυψαν ένα σπερματογονικό φραγμό(εικόνα 5.b).Αυτός ο φαινότυπος θα μπορούσε να δείχνει ότι οι όρχεις προέρχονται από εμβρυϊκές ορχι-ωοθήκες,αλλά θα μπορούσε επίσης να είναι αποτέλεσμα της υπερέκφρασης του Dax-1 μετά τη γέννηση.

Επομένως ,οι έρευνες στα ποντίκια Dax:Dax,έδειξαν ότι το Dax-1 είναι ήπιος ανταγωνιστής του Sry όταν εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα σε διαγονιδιακά ποντίκια.Αν αυτό συμβαίνει όντως ,τα δύο αντίγραφα του Dax-1 θα έπρεπε να έχουν μια πιο έντονη επίδραση πάνω σε ένα ασθενές αλληλόμορφο του Sry. Σχετικές έρευνες που έγιναν για να επιβεβαιωθεί η υπόθεση αυτή έδειξαν αντιστροφή του φύλου και έδωσαν είτε ΧΥ θηλυκά είτε ερμαφρόδιτα ζώα,αν και κάποια από τα τελευταία είχαν αρσενικό φαινότυπο κατά τη γέννηση.

Όλα τα παραπάνω,φανερώνουν ότι το Dax-1 και το Sry δρουν ανταγωνιστικά μεταξύ τους,με την αυξημένη έκφραση του πρώτου να οδηγεί στην ανάπτυξη θηλυκού και αυξημένη έκφραση του τελευταίου να οδηγεί στην ανάπτυξη αρσενικού.Έτσι,τα δεδομένα επιβεβαιώνουν την υπόθεση ότι το ανθρώπινο ομόλογο τουDax-1 είναι το υπεύθυνο γονίδιο για την αντιστροφή του φύλου.

Συμπερασματικά, μπορούμε να πούμε ότι μια ‘γονιδιακή διελκυστίνδα’ καθορίζει εαν το έμβρυο ενός θηλαστικού θα είναι θηλυκό ή αρσενικό.Στη μια πλευρά της, υπάρχει το γονίδιο SRY που εδώ και χρόνια έχει αναγνωριστεί ως ο ‘κύριος διακόπτης’ που οδηγεί στην ανάπτυξη του αρσενικού.Στην άλλη της πλευρά υπάρχει ένα δεύτερο γονίδιο,τοDAX-1,το οποίο προσπαθεί να μπλοκάρει τη δράση του SRY.Σχεδόν πάντα αποτυγχάνει.Όμως,σε σπάνιες περιπτώσεις,τα έμβρυα έχουν ένα επιπλέον αντίγραφο του γονιδίου DAX-1.Και όταν δύο DAX-1 γονίδια ανταγωνίζονται ένα μόνο γονίδιο SRY,η ‘διελκυστίνδα’ γέρνει προς την άλλη πλευρά και το έμβρυο γίνεται θηλυκό. Δεν έχει ακόμη διευκρινιστεί αν το DAX-1 προωθεί ενεργητικά την ανάπτυξη του θηλυκού ή αν απλά προσπαθεί να μπλοκάρει την ανάπτυξη του αρσενικού. Οι ερευνητές,όμως,πιστεύουν ότι μάλλον πρόκειται για ένα αντι-ορχικό γονίδιο,δεδομένου ότι στην αδιαφοροποίητη γονάδα έχουμε έκφραση του DAX-1, η οποία ελαττώνεται καθώς ο όρχις αναπτύσσεται στην αρσενική γονάδα ενώ διατηρείται καθώς αναπτύσσονται οι ωοθήκες στη θηλυκή γονάδα.

Διάφορα ιεραρχικά μοντέλα θα μπορούσαν να ερμηνεύσουν την αντιστροφή του φύλου που είχε παρατηρηθεί σε ασθενείς με διπλασιασμούς Χρ21. Θεωρήθηκε,επομένως, πιθανό ότι τα υψηλά επίπεδα του DAX-1 καταστέλλουν τη μεταγραφή του SRY ή ότι το SRY δεν μπορεί να καταστείλει περισσότερα από ένα αντίγραφα του DAX-1. Πλέον, όμως, θεωρείται σχεδόν απίθανο κάποιο από τα δύο γονίδια να δρα άμεσα επάνω στο άλλο. Κατά τη φυσιολογική ανάπτυξη της ΧΥ γεννητικής ακρολοφίας σε ποντίκια,τόσο τοSry όσο και το Dax-1 εκφράζονται κατά τη διάρκεια της κρίσιμης περιόδου πριν το σχηματισμό των ορχικών χορδών,και επιπλέον δέχονται αρνητική ρύθμιση την ίδια χρονική περίοδο. Επιπλέον,σε πειράματα που έγιναν,το επιπρόσθετο γονίδιο Dax-1 οδήγησε στην ανάπτυξη θηλυκού,όταν η έκφραση του Sry έγινε με ρυθμιστικές αλληλουχίες προερχόμενες από το Dax-1 καθώς και όταν το Sry ήταν κάτω από τον έλεγχο των δικών του ρυθμιστικών αλληλουχιών.Επομένως,τα πρωτεϊνικά προϊόντα των δύο γονιδίων πιθανότατα ανταγωνίζονται το ένα το άλλο όσον αφορά τον έλεγχο της ενεργοποίησης γονιδίων-στόχων.

Πώς γίνεται,όμως,ο ανταγωνισμός αυτός σε μοριακό επίπεδο;Πρόσφατα αποκτήσαμε στοιχεία ότι το DAX-1 μπορεί να σχηματίσει ετεροδιμερή με ένα συμβατικό μέλος της υπερ-οικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων ορμονών,το στεροειδογόνο παράγοντα 1(steroidogenic factor 1-SF1). Ο SF-1 είναι ουσιώδης για την πρώιμη ανάπτυξη των γονάδων.Υπάρχουν παρα πολλά στοιχεία που το αποδεικνύουν αυτό,κατά τη μεταγραφική ενεργοποίηση διαφόρων γονιδίων που απαιτούνται για τη λειτουργία των όρχεων,συμπεριλαμβανομένων των στεροειδογόνων γονιδίων και του Amh.Το DAX-1 μπορεί,ωστόσο,να δρα ως συγκαταστολέας μεταβάλλοντας τις ιδιότητες του SF-1 έτσι ώστε να μην ενεργοποιεί πλέον τα γονίδια-στόχους του. Με εξαίρεση τα κύτταρα Sertoli, το Dax-1 και το Sf-1 εκφράζονται πάντα ταυτόχρονα και η λειτουργία του πρώτου μπορεί γενικά να ρυθμίσει τη δραστηριότητα του τελευταίου.Αυτό υποδεικνύει ένα απλό μοντέλο,όπου τα ετεροδιμερή του DAX-1 και του SF-1 εξασφαλίζουν ότι δευτερεύοντα ορχεοκαθοριστικά γονίδια ,όπως το Sox9,καταστέλλονται κατά την ανάπτυξη της ωοθήκης. Στις ΧΥ γονάδες το SRY,πιθανώς μεταβάλλοντας τη διαμόρφωση του DNA,εμποδίζει τα ετεροδιμερή SF1-DAX1 να προσδεθούν και να συναρμολογηθούν στην αλληλουχία-στόχο τους,ενώ το SF-1 μόνο του μπορεί ακόμη να προσδένεται και να ενεργοποιεί.Ωστόσο,όταν το DAX-1 είναι παρόν σε ασυνήθιστα υψηλά επίπεδα ή όταν εκφράζεται νωρίς σε σχέση με το SRY ,τα σύμπλοκα των συγκαταστολέων ανταγωνίζονται την πρόσδεση του SF-1 και ίσως το ίδιο το SRY, έτσι ώστε το SOX9 να μη φτάνει ποτέ στο κρίσιμο κατώφλι που επιτρέπει τη διαφοροποίηση των κυττάρων Sertoli.

Μεταλλάξεις στο ανθρώπινο DAX-1 γονίδιο προκαλούν ένα φυλοσύνδετο στο Χ σύνδρομο, που λέγεται συγγενής υποπλασία των επινεφριδίων (AHC). Τα προσβεβλημένα αρσενικά άτομα παρουσιάζουν πρωταρχική ανεπάρκεια των επινεφριδίων κατά τη βρεφική ή την παιδική ηλικία και υπογοναδοτρόπο υπογοναδισμό κατά την εφηβεία.

Ο χαρακτηρισμός των αρσενικών ποντικών με ελαττωματικό Dax-1,αποκάλυψε ουσιώδεις ορχικές ανεπάρκειες,που συμπεριλαμβάνουν την υπερπλασία των κυττάρων Leydig (LHC-Leydig Cell hyperplasia) και τον προοδευτικό εκφυλισμό του σπερματικού επιθηλίου,που οδηγεί σε στειρότητα.Σε μελέτες που έγιναν,ερευνήθηκε η επίδραση των μεταλλαγών του Dax-1 στην έκφραση διαφόρων γονιδίων που κωδικοποιούν για στεροειδογόνα ένζυμα,σε κύτταρα Leydig που απομονώθηκαν από ποντίκια με ελαττωματικό Dax-1.Η έκφραση του γονιδίου της αρωματάσης(Cyp19), το οποίο κωδικοποιεί για το ένζυμο που μετατρέπει την τεστοστερόνη σε οιστραδιόλη,αυξήθηκε σημαντικά στα κύτταρα Leydig που απομονώθηκαν από μεταλλαγμένα ποντίκια.Αντίθετα,η έκφραση άλλων πρωτεϊνών,όπως StAR και Cyp11a δεν μεταβλήθηκε.Σε in vitro έρευνες επιμόλυνσης,το DAX-1 κατέστειλε την ενεργοποίηση του υποκινητή του γονιδίου Cyp19,που διαμεσολαβείται από τον παράγοντα SF-1, αλλά δεν εμπόδισε τους υποκινητές των γονιδίων StAR και Cyp11a. Αυξημένη έκφραση του Cyp19 συνοδευόταν από αυξημένα ενδοορχικά επίπεδα οιστραδιόλης. Η διαχείριση της ταμοξιφίνης,ενός επιλεκτικού ρυθμιστή των υποδοχέων των οιστρογόνων,αποκατέστησε τη γονιμότητα στα αρσενικά ποντίκια με ελαττωματικό Dax-1 και μερικώς διόρθωσε την υπερπλασία των κυττάρων Leydig. Έτσι,αποδείχτηκε ότι η περίσσεια οιστρογόνων συμβάλλει στην υπερπλασία των κυττάρων Leydig και στη στειρότητα.Βάσει αυτών των in vivo και in vitro αναλύσεων,προκύπτει ότι η αρωματάση είναι ο φυσιολογικός στόχος του Dax-1 στα κύτταρα Leydig και ότι η αυξημένη έκφραση του Cyp19 μπορεί να θεωρηθεί εν μέρει υπεύθυνη για τη στειρότητα και την υπερπλασία των κυττάρων Leydig στα ποντίκια με μεταλλαγές στο γονίδιο Dax-1.

Η πλειοψηφία των μεταλλαγών του DAX-1,που έχουν περιγραφεί ως τώρα,είναι ανερμηνεύσιμες μεταλλαγές ή μεταλλαγές μετατόπισης του πλαισίου ανάγνωσης που έχουν ως αποτέλεσμα την πρόωρη λήξη της μετάφρασης της πρωτεϊνης που κωδικοποιείται από το DAX-1 και την απώλεια της δράσης της ως καταστολέας.Σχετικά λίγες παρερμηνεύσιμες μεταλλαγές του DAX-1 έχουν αναφερθεί.Αυτές οι παρερμηνεύσιμες μεταλλαγές φαίνεται ότι συγκεντρώνονται σε περιορισμένες περιοχές της υποτιθέμενης θέσης πρόσδεσης της πρωτεΐνης του DAX-1 και επηρεάζουν αμινοξέα που διατηρήθηκαν κατά την εξέλιξη,κάτι που δείχνει όι αυτές οι περιοχές έχουν πολύ μεγάλη λειτουργική σημασία.Μεταγραφικές δοκιμές,με τη χρήση μιας ποικιλίας τεχνητών και φυσικών γονιδίων-στόχων,έγιναν προκειμένου να προσδιοριστεί η επίδραση αυτών των μεταλλαγών στη λειτουργία του DAX-1. Όλα τα παράγωγα του DAX-1,που έφερε παρερμηνεύσιμες μεταλλαγές, παρουσίασαν σαφή απώλεια της δράσης τους ως καταστολείς.Εξαίρεση αποτέλεσε η I439S,μια μεταλλαγή που έχει αποδειχτεί ότι σχετίζεται με την καθυστερημένη έναρξη της ανεπάρκειας των επινεφριδίων και με τον μη ολοκληρωτικό υπογοναδοτρόπο υπογοναδισμό.Τα δεδομένα αυτά υποδεικνύουν ότι οι περισσότερες παρερμηνεύσιμες μεταλλαγές του DAX-1,που σχετίζονται με την κλασική συγγενή υποπλασία των επινεφριδίων,εμφανίζουν σαφή απώλεια λειτουργίας.Οι θέσεις αυτών των μεταλλαγών εκεί κοντά υποδεικνύουν σημαντικές λειτουργικές περιοχές στο καρβοξυ-τελικό άκρο της πρωτεΐνης.

Συμπερασματικά,έχει αναπτυχθεί ένα διαγονιδιακό μοντέλο για τη μελέτη των γεγονότων της φυλετικής διαφοροποίησης στα θηλαστικά.Τα υπάρχοντα στοιχεία δείχνουν τη λειτουργία του Dax-1 ως αντιορχικό γονίδιο αφού ανταγωνίζεται το Sry. Ο μηχανισμός του φυλοκαθορισμού που αποκαλύπτεται είναι εξαιρετικά ευαίσθητος στα επίπεδα και στο συγχρονισμό της έκφρασης και των δύο αυτών γονιδίων.Επομένως,ο φυλοκαθορισμός στα θηλαστικά είναι τμήμα ενός ταχύτατα αναπτυσσόμενου συστήματος με τα γονίδια Dax-1 και Sry στην κορυφή της ιεραρχίας.

1. G.Scherer-The molecular genetic jigsaw of vertebrate sex determination and it’s missing pieces.
2. Andreas Schedl-Early gonadal development.
3. Blanche Capel,Jennifer Brennan,Jennifer Schmahl,Christopher Tilmann, Humphrey Yao-The battle of the sexes:Sry and the control of testis organogegesis.
4. THE GENETICS AND BIOLOGY OF SEX DETERMINATION
5. Symposium 244,held in London,1-3 May 2001
6. P.C.Sizonenko,Division of Biology of Growth and Reproduction, Department of Pediatrics,University Cantonal Hospital,1211 Geneva 14,Switzerland-Human sexual differentiation
7. Ρωξάνη Αγγελοπούλου-Εμβρυολογία ΙΙ:409-424
8. Bandoni B,Zanaria E,Guioli S,Floridia G,Worley KC,Tonini G,Ferrante E, Chiumello G,McCabe ER,Fraccaro M, et al.-A dosage sensitive locus at chromosome Xp21 is involved in male to female sex reversal.-Nat Genet 1994 Aug;7(4):497-501
9. Parma P,Pailhoux E,Puissant C,Cotinot C.-Porcine Dax-1 gene:isolation and expression during gonadal development.-Mol Cell Endocrinol 1997 Nov 30;135(1):49-58
10. Wang ZJ,Jeffs B,Ito M,Achermann JC,Yu RN,Hales DB,Jameson JL.- Aromatase(Cyp19) expression is up-regulated by a targeted disruption of Dax1.-Proc Natl Acad Sci USA 2001 Jul 3;98(14):7988-93
11. Achermann JC,Ito M,Silverman BL,Habiby RL,Pang S,Rosler A,Jameson JL.-Missense mutations cluster within the carboxyl-terminal region of DAX-1 and impair transcriptional repression.-Clin Endocrinol Metab 2001 Jul;86(7):3171-5
12. Swain A,Narvaez V,Burgoyne P,Camerino G,Lovell-Badge R.-Dax1 antagonizes Sry action in mammalian sex determination.-Nature 1998 Feb 19;391(6669):761-7
13. Goodfellow PN,Camerino G.-DAX-1,an “antitestis” gene.-EXS 2001;(91): 57-69
14. Baumstark A,Barbi G,Djalali M,Geerkens C,Mittula B,Mattfeldt T, de Almeida JC,Vargas FR,Llerena Junior JC,Vogel W,Just W.-Xp-duplications with and without sex reversal.-Hum Genet 1996 Jan;97(1):79-86
15. Veitia RA,Salas-Cortes L,Ottolenghi C,Pailhoux E,Cotinot C,Fellous M.- Testis determination in mammals:more questions than answers.-Mol Cell Endocrinol 2001 Jun 20;179(1-2):3-16

Εργασία που παρουσιάστηκε από τη φοιτήτρια Νιφοροπούλου Παναγιώτα, με ΑΜ 200000168
στα πλαίσια του κατ'επιλογήν μαθήματος της Πειραματικής Εμβρυολογίας
Υπεύθυνη μαθήματος : Ρωξάνη Αγγελοπούλου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια
Εργαστήριο Ιστολογίας και Εμβρυολογίας
Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών
Για περισσότερες πληροφορίες μπορείτε να ανατρέξετε στον ιστότοπο του μαθήματος της Πειραματικής Εμβρυολογίας: http://www.med.uoa.gr/expembr/
Τελευταία αναθεώρηση : 1/7/2006