Όπως προαναφέραμε, τα γονίδια που καθορίζουν άμεσα ή σχετίζονται έμμεσα με το φύλο είναι κυρίως τα γονίδια Sry, Dax1, Sox9 και Amh στο ποντίκι ή τα ομόλογά τους στον άνθρωπο SRY, DAX1, SOX9 και AMH ( Για λόγους διάκρισης γράφουμε συμβατικά τα ομόλογα γονίδια στον άνθρωπο με κεφαλαία). Η εντόπιση των μεταγραφών των γονιδίων αυτών στο ποντίκι εξετάστηκε στην ουρογεννητική καταβολή με την τεχνική του in situ υβριδισμού.

Ο in situ υβριδισμός είναι ένας από τους αμεσότερους τρόπους χαρτογράφησης ενός γονιδίου ή εντόπισης του μεταγράφου του, καθόσον παρέχει ένα άμεσο ορατό σήμα. Βασίζεται στο μοριακό υβριδισμό μιας κλωνοποιημένης αλληλουχίας DNA με μεταφασικά χρωμοσώματα, τα οποία είναι διατεταγμένα σε μία αντικειμενοφόρο πλάκα. Ο ανιχνευτής σημαίνεται με τέτοιο ώστε η παρουσία του να μπορεί να ανιχνευτεί είτε με ραδιενέργεια (συνήθως χρησιμοποιώντας τρίτιο ως ραδιενεργό ιχνηθέτη) ή με φθορίζουσα σήμανση. Τα μεταφασικά χρωμοσώματα αποδιατάσσονται στη θέση τους πάνω στην αντικειμενοφόρο πλάκα και ο σημασμένος ανιχνευτής υβριδοποιείται με εκείνα. Η περίσσεια του ανιχνευτή ξεπλένεται και η θέση του γίνεται ορατή με φιλμ ακτίνων Χ ή με φθορισμό. Πιο πρόσφατα, η διαδικασία της ραδιενεργού σήμανσης αντικαταστάθηκε με μια μέθοδο φθορισμού. Σε ένα συχνά χρησιμοποιούμενο πρωτόκολλο, ο DNA ανιχνευτής σημαίνεται με μία βιταμίνη που ονομάζεται βιοτίνη , υβριδοποιείται στην επίστρωση των μεταφασικών χρωμοσωμάτων και μετά ο ανιχνευτής γίνεται ορατός χρησιμοποιώντας την πολύ ισχυρή πρόσδεση της σημασμένης με φθόριο στρεπταβιδίνης στη βιοτίνη. Ένα από τα προτερήματα αυτής της προσέγγισης είναι ότι η ευκρίνεια του in situ υβριδισμού επιτρέπει τον εντοπισμό μιας αλληλουχίας DNA σε μία χρωμοσωμική ζώνη. Στην εικόνα 1 παρουσιάζεται ο in situ υβριδισμός με μεταφασικά χρωμοσώματα , ενώ στην εικόνα 2 επεξηγείται ο in situ υβριδισμός με μετάγραφα γονιδίων.

Στο ποντίκι, το γονίδιο Sry , το οποίο θεωρείται ως ο ορχεοκαθοριστικός παράγοντας (TDF- Testis Determining Factor) , εκφράζεται στα σπερματοκύτταρα και στα κύτταρα της γεννητικής ακρολοφίας. Με ποσοτικές τεχνικές προκύπτει ένα λεπτομερές χρονοδιάγραμμα της έκφρασης του γονιδίου Sry. Τα πρώτα μετάγραφα του γονιδίου SRO εντοπίζονται σε έμβρυα ΧΙ μόλις μετά από 10.5 ημέρες post coitus (δηλαδή από τη στιγμή της γονιμοποίησης), φθάνουν στην κορυφή τους στις 11.5 ημέρες και έπειτα επέρχεται τόσο απότομη ελάττωση τους , ώστε μετά από 24 ώρες (στις 12.5 , δηλαδή, ημέρες post coitum) δεν εντοπίζεται πια κανένα. Σε έμβρυα ΧΧ 11.5 ημερών δεν εκφράζεται το γονίδιο Sry.

Στη συνέχεια, στα έμβρυα ΧΥ 20 ώρες μετά την αρχή της έκφρασης του γονιδίου Sry, και καθώς τα μετάγραφα του γονιδίου Sry είναι στο αποκορύφωμά τους , αρχίζει η έκφραση του γονιδίου της λεγόμενης αντιμυλλεριανής ορμόνης. Ονομάζεται γονίδιο Amh και είναι υπεύθυνο για την παραγωγή από τα κύτταρα του Sertoli της αντιμυλλεριανής ορμόνης. Αν και η χρονική σχέση μεταξύ της έκφρασης των γονιδίων Amh και Sry δεν αποδεικνύει άμεση συσχέτιση μεταξύ των δύο γονιδίων, είναι ενδεικτική της κρίσιμης περιόδου εντός της οποίας φαίνεται ότι δρα το γονίδιο Sry , για να αρχίσει τη διαφοροποίηση των κυττάρων του Sertoli. Όπως προαναφέραμε, τα μετάγραφα του γονιδίου Amh εντοπίζονται 12.5 ημέρες post coitum, οπότε οι διαφορές μεταξύ των όρχεων και των ωοθηκών αρχίζουν να γίνονται ορατές. Το σήμα του εντοπισμού είναι ειδικό για τα κύτταρα του Sertoli.

Το γονίδιο Dax1 εντοπίζεται στη γεννητική ακρολοφία σε έμβρυα ΧΥ 11.5 ημερών. Στα έμβρυα ΧΧ 11.5 ημερών εντοπίζεται με την ίδια ένταση που παρατηρείται στη ΧΥ γοναδική καταβολή. Μία ημέρα αργότερα η έκφραση του Dax1 σε έμβρυα ΧΧ διατηρείται μόνο μεταξύ γονάδας και μεσονέφρου. Η ένταση του σήματος του γονιδίου Dax1 σε έμβρυα ΧΧ είναι ανάλογη της έντασης του σήματος που παρατηρείται στις ΧΥ γονάδες, ίδιας ηλικίας, για τα γονίδια Sox9 και Amh.

Όσον αφορά στα υπόλοιπα γονίδια που σχετίζονται με το φύλο, μπορούμε να πούμε τα εξής:

Το γονίδιο Sox9 εκφράζεται στα κύτταρα του Sertoli καθ’όλη τη διάρκεια της ανάπτυξης του εμβρύου του ποντικού. Σε έμβρυα ΧΥ εντοπίζονται στη γεννητική ακρολοφία τα μετάγραφα του γονιδίου Sox9 στις 11.5 ημέρες post coitum. Στις γεννητικές ακρολοφίες των ΧΧ εμβρύων δεν εκφράζεται το γονίδιο Sox9.

Επίσης, το γονίδιο του SF-1 (ή ορφανός πυρηνικός υποδοχέας) εκφράζεται στα κύτταρα του Sertoli και πιστεύεται ότι αυτό ενεργοποιεί το γονίδιο της αντιμυλλεριανής ορμόνης, το λεγόμενο Amh.

Στον πίνακα 1, ταξινομούνται όλα τα προαναφερόμενα γονίδια , ανάλογα με την έκφρασή τους σε έμβρυα ΧΥ και ΧΧ, τόσο στις 11.5 όσο και στις 12.5 ημέρες post coitum. Στον πίνακα 2 και στην εικόνα 3, παρουσιάζονται συνολικά τα γονίδια που εμπλέκονται στον καθορισμό του φύλου στα θηλαστικά.

Θα πρέπει να τονίσουμε ότι στις 11.5 ημέρες post coitum το γονίδιο Dax1 και το γονίδιο Sox9 εκφράζονται με την ίδια ένταση σε όλη την έκταση της αναπτυσσόμενης ΧΥ γονάδας, από το κεφαλικό μέχρι το ουραίο άκρο. Αντίθετα, η έκφραση του γονίδιου Sry (στις 11.5 ημέρες) είναι ασθενής στο κεφαλικό άκρο , ενώ στο ουραίο άκρο φαίνεται εντονότερη. Το γεγονός αυτό μπορεί να αντανακλά ένα κύμα έκφρασης ανάλογο της διαφοροποίησης των κυττάρων Sertoli, η οποία ως γνωστόν εξελίσσεται σταδιακά από το κεφαλικό προς το ουραίο άκρο της γοναδικής καταβολής. Πράγματι, εντονότερη έκφραση του γονιδίου Sry παρατηρείται σε πρωιμότερο στάδιο στο κεφαλικό άκρο της γονάδας, σύμφωνα με την αρχή της κεφαλοουραίας πορείας της ανάπτυξης.

Ένα άλλο σημείο , το οποίο θα πρέπει να τονιστεί, είναι ότι τα περισσότερα πειράματα έχουν γίνει σε έμβρυα ποντικού και ότι οι 11.5 ημέρες post coitum , που συχνά αναφέρονται, αντιστοιχούν στον άνθρωπο στις 5-6 εβδομάδες.

Συμπερασματικά, τα γονίδια Dax1 και Sry δρουν ανταγωνιστικά και τα πρωτεϊνικά τους προϊόντα ανταγωνίζονται για τον έλεγχο της ενεργοποίησης των γονιδίων στόχων. Η αυξημένη έκφραση του πρώτου γονιδίου οδηγεί στην ανάπτυξη της ΧΧ γονάδας, ενώ η αυξημένη δραστηριότητα του δεύτερου στην ανάπτυξη της ΧΥ γονάδας.

Τέλος, ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι Αυστραλοί επιστήμονες ( Smith CA, Smith MJ, Sinclair AH) διεξήγαγαν πρόσφατα πειράματα σε έμβρυα κοτόπουλων. Με τη βοήθεια των τεχνικών της αντίστροφη μεταγραφής και της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης( PCR: Polymerase Chain Reaction), μελέτησαν την έκφραση των γονιδίων Amh, Sox9, Sox3, WT-1, SF-1 και Dax1. Σύμφωνα με τα πειράματά τους, το γονίδιο που κωδικοποιεί την αντιμυλλεριανή ορμόνη εκφράζεται και στα δύο φύλα πριν και κατά τη διάρκεια της γοναδικής διαφοροποίησης, με τα επίπεδα της έκφρασης του γονιδίου ασφαλώς υψηλότερα στα ΧΥ έμβρυα από τα ΧΧ έμβρυα. Η έκφραση του γονιδίου Sox9 είναι ειδική στα ΧΥ έμβρυα. Η έκφραση του γονιδίου Sox3 είναι προγενέστερη της έκφρασης του γονιδίου Sox9 και υφίσταται και στα δύο φύλα. Το γονίδιο WT-1 εκφράζεται υψηλά και στα δύο φύλα, ενώ η έκφραση του γονιδίου SF-1 είναι εμφανώς υψηλότερη στις αναπτυσσόμενες ωοθήκες από ό,τι στους όρχεις. Τέλος, τα μετάγραφα του γονιδίου Dax1 παρατηρούνται και στα δύο φύλα, αν και η έκφραση του γονιδίου αυτού είναι κάπως υψηλότερη στα έμβρυα ΧΧ.

1. Ρωξάνη Αγγελοπούλου . Εμβρυολογία Ι & ΙΙ , Εκδ: Πασχαλίδης
2. Ρωξάνη Αγγελοπούλου . Πειραματική εμβρυολογία, Εκδ. Πασχαλίδης 2000
3. Hacker A, Capel B, Goodfellow PN, Lovell-Badge R. Expression of Sry, the mouse sex determining gene. Development 1995, 121 : 1603-1614.
4. Mc Elreavy K , Fellous M. Sex-determining genes. TEM 1997, 8 : 342-346.
5. Munsterberg A, Lovell- Badge R. Expression of the mouse anti-mullerian hormone gene suggests a role in both male and female sexual differentiation. Development 1991 Oct, 113 (2) : 613-624.
6. Smith CA, Smith MJ, Sinclair AH. Gene expression during gonadogenesis in the chicken embryo. Gene 1999 July 8, 234 (2) :395-402.
7. Swain A, Lovell- Badge R. Mammalian sex determination : a molecular drama. Genes Dev 1999, 13 : 755- 767.
8. Swain A, Lovell- Badge R. A molecular approach to sex determination in mammals. Acta Paediatr Suppl 1997 Nov , 423 : 46-49.
9. Swain A, Narvaez V, Burgoyne P, Camerino G, Lovell- Badge R. Dax1 antagonizes Sry action in mammalian sex determination. Nature 1998, 391 : 761-767.

Εργασία που παρουσιάστηκε από το φοιτητή Δημητρόπουλο Γεώργιο, με ΑΜ 200000046
στα πλαίσια του κατ'επιλογήν μαθήματος της Πειραματικής Εμβρυολογίας
Υπεύθυνη μαθήματος : Ρωξάνη Αγγελοπούλου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια
Εργαστήριο Ιστολογίας και Εμβρυολογίας
Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών
Για περισσότερες πληροφορίες μπορείτε να ανατρέξετε στον ιστότοπο του μαθήματος της Πειραματικής Εμβρυολογίας: http://www.med.uoa.gr/expembr/
Τελευταία αναθεώρηση : 1/7/2006