ΥΠΟΓΟΝΙΜΟΤΗΤΑ

Ρ. Αγγελοπούλου Αν. Καθηγήτρια

ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗΕργαστήριο Ιστολογίας & Εμβρυολογίας

ΥΠΟΓΟΝΙMOΤΗΤΑ

Αδυναμία ζεύγους προς τεκνοποίηση μετά από προσπάθειες ενός έτους με «απροφύλακτες» φυσιολογικές σεξουαλικές επαφές. Περιλαμβάνει και την αδυναμία της γυναίκας να φέρει σε πέρας την κύηση, δηλαδή σε βιώσιμη ηλικία για το έμβρυο. Η λέξη στειρότητα που υποδηλώνει μόνιμη κατάσταση δεν χρησιμοποιείται.

ΣΤΟΧΟΙ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗΣ

Προσδιορισμός της αιτίας. Εξετάζεται το ζεύγος και όχι χωριστά ο κάθε σύζυγοςΑπομυθοποίηση του προβλήματοςΨυχολογική υποστήριξηΧρονοδιάγραμμα διάγνωσης και θεραπείαςΘεραπεία

ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΥΠΟΓΟΝΙΜΟΤΗΤΑΣ

Εξετάζεται το ζεύγος (Couple investigation)Για περιγραφικούς λόγους εξετάζεται χωριστά η γυναικεία υπογονιμότητα (female infertility) και η ανδρική υπογονιμότητα (male infertility)

ΓΥΝΑΙΚΑ ΜΕ ΠΡΟΒΛΗΜΑ ΥΠΟΓΟΝΙΜΟΤΗΤΑΣ

ΙστορικόΚλινική εξέτασηΘεραπεία

ΙΣΤΟΡΙΚΟ

ΗλικίαΣεξουαλικές σχέσειςΜαιευτικό ιστορικόΈμμηνος ρύσηΑντισύλληψηΑτομικό αναμνηστικό

ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ

Έλεγχος ΒάροςΤρίχωσηΘυρεοειδής

ΑΙΤΙΟΛΟΓΙΑ ΥΠΟΓΟΝΙΜΟΤΗΤΑΣ

Κολπικός παράγονταςΤραχηλικός παράγονταςΣαλπιγγικός παράγονταςΩορρηξίαΕνδομητρίωση

Κολπικός παράγοντας

ΔυσπαρεύνειαΣτενώσεις άνω τριτημορίου ή διαφράγματα

Τραχηλικός παράγοντας

10% των περιπτώσεων υπογονιμότηταςΣτένωση ή καταστροφή του βλεννοεκκριτικού επιθηλίου λόγω κακής τεχνικής κατά τη θεραπεία χρονίας τραχηλίτιδοςΑντισώματα ορού ή/και τραχηλικής βλέννης (5-10% των γυναικών)Έρευνα για την ανίχνευση των αντισωμάτων στον ορό ή/και στην τραχηλική βλέννα πρέπει να γίνεται όταν μετά από επαφή και παρά το φυσιολογικό σπερμοδιάγραμμα παρατηρείται ακινητοποίηση ή μαζική συγκόλληση των σπερματοζωαρίων ή/και σπερματοζωάρια με κίνηση της ουράς (shaking phenomenon).

Εξέταση τραχηλικής βλέννης

Πρέπει να γίνεται κατά την ημέρα της ωοθυλακιορρηξίας, όπως υπολογίζεται από τη διάρκεια του κύκλου και το θερμομετρικό διάγραμμα.Εξετάζεται η ποσότητα, το χρώμα το ιξώδες, η εκτασιμότητα, η κυτταροβρίθεια και η δυνατότητα της βλέννης να δίνει εικόνα πολύκλαδης φτέρης (Fem Pattem) στην μικροσκοπική εξέταση, δηλαδή, αφού αποξηρανθεί.

Εξέταση μετά από επαφή (δοκιμασία Sims-Huhner)

Χαρακτήρας βλέννης Η φυσιολογική ωοθυλακιορρηκτική βλέννα είναι καθαρή, λεπτόρευστη, άφθονη, διαυγής και σχηματίζει φτέρη. 48 ώρες μετά την ωορρηξία η βλέννα είναι λίγη, παχύρευστη και κολλώδης.Σπερματοζωάρια στη βλέννα1-20/οπτικό πεδίο.1-2 κινητά σπερματοζωάρια/οπτικό πεδίο θεωρείται ικανοποιητικός αριθμός και δεν συντρέχει λόγος επανάληψης της εξέτασης.Η πρόγνωση είναι δυσμενής όταν δεν υπάρχουν σπερματοζωάρια ή όταν υπάρχουν αλλά είναι ακίνητα.

ΜΗΤΡΑ

Εξετάζονται οι χαρακτήρες της εμμήνου ρύσεως, ζητούνται πληροφορίες για επεμβάσεις στη μήτρα, γίνεται γυναικολογική εξέταση, υστεροσαλπιγγογραφία, υστεροσκόπηση. Αίτια υπογονιμότητας είναι οι συμφύσεις και σπανιότερα τα ινομυώματα και οι πολύποδες.

ΣΑΛΠΙΓΓΕΣ

Στο 30-50% των γυναικών με πρόβλημα στειρότητας ο έλεγχος δείχνει βλάβη στις σάλπιγγες. Από το ιστορικό έχουν σημασία :Φλεγμονώδεις νόσοι της πυέλουΣηπτικές εκτρώσειςΧρήση ενδομήτριων σπειραμάτωνΈκτοπη κύησηΣκωληκεοειδεκτομή, ινομυωματεκτομή, επεμβάσεις στις ωοθήκες.

ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΔΙΑΒΑΤΟΤΗΤΑΣ ΣΑΛΠΙΓΓΩΝ

ΕμφύσησηΥστεροσαλπιγγογραφίαΛαπαροσκόπηση

ΑΝΤΕΔΕΙΞΕΙΣ ΥΣΤΕΡΟΣΑΛΠΙΓΓΟΓΡΑΦΙΑΣ

Φλεγμονές γεννητικών οργάνωνΜητρορραγίαΕνεργός φυματίωση γεννητικών οργάνωνΥδροσάλπιγγαΥποψία εγκυμοσύνης

ΑΙΤΙΟΛΟΓΙΑ ΣΑΛΠΙΓΓΙΚΗΣ ΒΛΑΒΗΣ

Φλεγμονές ΣυμφύσειςΦυματίωσηΕνδομητρίωσηΟζώδης σαλπιγγίτις του ισθμούΔιαμαρτίες διάπλασηςΝεοπλασματικές εξεργασίες

ΩΟΡΡΗΞΙΑ

Τέλεια έλλειψηΑνωμαλίες

ΘΕΡΜΟΜΕΤΡΙΚΟ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ

Βασίζεται στην αύξηση της βασικής θερμοκρασίας του σώματος (ΒΒΤ) που προκαλείται από την προγεστερόνη.Συνηθέστερες τιμές πριν από την ωορρηξία είναι 36.2 - 36.3 °C και μετά την ωορρηξία > 36.6 °C.Το διάγραμμα ΒΒΤ βοηθάει όταν είναι διφασικό. Η διφασικότητα οφείλεται στην αύξηση της θερμοκρασίας, 2 μέρες μετά την αύξηση της LH που συμπίπτει με την αύξηση προγεστερόνης στον ορό >4ng/ml. Η ωορρηξία γίνεται 1 μέρα πριν από την αύξηση και αντιστοιχεί στην χαμηλότερη τιμή της καμπύλης. Η αύξηση διατηρείται 11-14 ημέρες και ελαττώνεται την ημέρα της αναμενόμενης εμμηνορρυσίας.

ΘΕΡΜΟΜΕΤΡΙΚΟ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ

ΑΝΩΜΑΛΙΕΣ ΒΒΤ

Σε γυναίκες με διαταραχή της λειτουργίας του θυρεοειδή και σε νευρικά – αγχώδη άτομα παρατηρούνται διφασικές καμπύλες. Σε ανεπάρκεια του ωχρού σωματίου η καμπύλη είναι διφασική αλλά η φάση της υπερθερμία διαρκεί <11 ημέρες.Αν η καμπύλη είναι μονοφασική με υπερθερμία αυτό μπορεί να σημαίνει εγκυμοσύνη, ιδιαίτερα αν συνυπάρχει και καθυστέρηση έμμηνου ρύσεως, λοίμωξη ή υπερθυρεοειδισμός.Μόνιμες χαμηλές τιμές θερμοκρασίας υποδηλώνουν έλλειψη ωοθυλακιορρηξίας.

ΒΙΟΨΙΑ ΕΝΔΟΜΗΤΡΙΟΥ

Με την ιστολογική εξέταση του ενδομητρίου ελέγχεται η αντίδραση του στην επίδραση της προγεστερόνης.Για τον έλεγχο της ύπαρξης ή όχι ωοθυλακιορρηξίας γίνεται σε οποιαδήποτε ημέρα της β΄ φάσης του θερμομετρικού διαγράμματος.Για την αξιολόγηση της ωρίμανσης του κάτω από την επίδραση της προγεστερόνης λαμβάνεται δείγμα 2 – 3 ημέρες πριν από την εμμηνορρυσία

ΜΕΤΡΗΣΗ ΠΡΟΓΕΣΤΕΡΟΝΗΣ

Επίπεδα προγεστερόνης του ορού = ή > των 3-4 ng/ml είναι ενδεικτικά ωορρηξίας.Τονίζεται ότι η τιμή της προγεστερόνης στο μέσο της ωχρινικής φάσης θα πρέπει να είναι = ή > των 10 ng/ml. Μικρότερες τιμές μπορεί να σημαίνουν ανεπαρκή παραγωγή της ορμόνης από το ωχρό σωμάτιο.

ΑΝΕΠΑΡΚΗΣ ΩΧΡΙΝΙΚΗ ΦΑΣΗ

Διαπιστώνεται περίπου σε 3-4% των γυναικών με πρόβλημα υπογονιμότητας.Οφείλεται σε σχετική ανεπάρκεια παραγωγής προγεστερόνης από το ωχρό σωμάτιο. Συνεπώς, το ενδομήτριο αναπτύσσεται ανώμαλα με αποτέλεσμα αδυναμία εμφύτευσης του γονιμοποιημένου ωαρίου ή καθ’ έξιν αποβολές.Οφείλεται κυρίως σε διαταραχές του υποθαλαμοϋποφυσιακού άξονα: Μειωμένη έκκριση FSH στην αρχή του κύκλου, ανεπαρκής αιχμή LH στο μέσο του κύκλου ή ανεπαρκής έκκριση LH κατά το εκκριτικό στάδιο και διαταραχή της σχέσης FSH/LH.Την υποψιαζόμεθα σε γυναίκες με ομαλό κύκλο και ανεξήγητη υπογονιμότητα με βραχεία ωχρινική φάση στο θερμομετρικό διάφραγμα ή τιμή προγεστερόνης < 10ng/ml στο μέσο της ωχρινικής φάσης και σε γυναίκες με ιστορικό καθ’ έξιν αποβολών.

ΕΝΔΟΜΗΤΡΙΩΣΗ

Είναι η ανάπτυξη ενδομητρικού βλεννογόνου εκτός της κοιλότητας της μήτρας. Το 30% των γυναικών που πάσχουν έχουν πρόβλημα υπογονιμότητας. Από το 15% στο σύνολο των προβλημάτων υπογονιμότητας το 10% περίπου έχει πρόβλημα ενδομητρίωσης.

ΑΝΑΛΥΣΗ ΣΠΕΡΜΑΤΟΣ

Το σπέρμα συλλέγεται μετά από αποχή 48-72 ωρών και εξετάζεται εντός μιας ώρας. Το 50% των σπερματοζωαρίων θα πρέπει να δείξει μια καλή κινητικότητα 2 ώρες μετά τη λήψη. Η μορφολογία θα πρέπει να είναι φυσιολογική σε ποσοστό > του 60%. Κατώτερο φυσιολογικό όριο 20.000.000/ml. Όταν ο αριθμός κυμαίνεται μεταξύ 10.000.000 και 19.000.000/ ml απαιτούνται τουλάχιστον τρία δείγματα για να τεκμηριωθεί η απάντηση. Η επανάληψη θα πρέπει να γίνεται σε διάστημα 74 ημερών, που απαιτείται για τη φυσιολογική ωρίμανση των σπερματοζωαρίων. Το ίδιο ισχύει και για την κινητικότητα όταν προσδιορίζεται μεταξύ 40 και 60%.

Ο ΟΓΚΟΣ ΤΟΥ ΣΠΕΡΜΑΤΟΣ

Κυμαίνεται φυσιολογικά μεταξύ 2,5 και 4 ml.Μικρός όγκος < 1,5 ml παρατηρείται σε υπογοναδισμό και σε απόφραξη των σπερματοδόχων κύστεων. Μειονεκτικός είναι επίσης και ο μεγάλος όγκος > 6ml διότι συνεπάγεται αραίωση των σπερματοζωαρίων.

ΡΕΥΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΣΠΕΡΜΑΤΟΣ

Γίνεται εντός 20-30 min. Καθυστέρηση παρατηρείται σε φλεγμονές του προστάτη.

ΣΥΓΚΟΛΛΗΣΗ ΤΩΝ ΣΠΕΡΜΑΤΟΖΩΑΡΙΩΝ

Μπορεί να εμφανιστεί και φυσιολογικά αλλά αν επιμένει σε επανειλημμένα δείγματα μπορεί να σημαίνει φλεγμονή ή αυτοάνοση αντίδραση.

Πυοσφαίρια, pH

Πυοσφαίρια > 8-10 ανά οπτικό πεδίο υποδηλώνει φλεγμονή στον προστάτη ή την ουρήθρα.Το pΗ (φυσιολογικό 7.2-7.8) αλκαλοποιείται σε διάφορες φλεγμονές.

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΟΥΣΙΩΝ ΣΤΟ ΣΠΕΡΜΑ

Απουσία φρουκτόζης σημαίνει απόφραξη σπερματοδόχων κύστεων ως την εκβολή των εκσπερματικών πόρων. Μείωσή της παρατηρείται σε φλεγμονές των σπερματοδόχων κύστεων. Ο ψευδάργυρος (1.5mg/100ml) μειώνεται στις φλεγμονές του προστάτη.Έλλειψη καρνιτίνης και γλυκερυλ – φωσφορυλ – χολίνης υποδεικνύει ως σημείο απόφραξης την επιδιδυμίδα.

Αζωοσπερμία μη αποφρακτικής αιτιολογίας Διακοπή ωρίμανσης σπερματοζωαρίων Σύνδρομο Sertoli(Sertoli cell only syndrome)Αζωοσπερμία αποφρακτικής αιτιολογίας Απόφραξη των σπερματικών πόρων Συγγενής έλλειψη σπερματικών πόρων Πλήρης απουσία σωμάτων των επιδιδυμίδων Απουσία εκσπερματιστικών πόρων Αποτυχημένη εγχείρηση κιρσοκήλης Φλεγμονή της επιδιδυμίδας

Αιτιολογία αζωοσπερμίας

Και στις δύο περιπτώσεις αζωοσπερμίας χρησιμοποιούνται σπερματοζωάρια σε διαφορετικά στάδια ωρίμανσης ξεκινώντας από στρογγύλες σπερματίδες.Με την εφαρμογή της μεθόδου ICSI τα αποτελέσματα γονιμοποίησης είναι πολύ ικανοποιητικά.

Ομόλογη (Από το σπέρμα του συζύγου). Ετερόλογη (Από σπέρμα δότη)Προσδιορίζεται ο χρόνος της ωορρηξίας και γίνεται 1 ή και 2 ημέρες πριν. Συνήθως γίνονται 1-3 εγχύσεις κάθε μήνα και περίπου το 50% των επιτυχημένων αποτελεσμάτων εμφανίζεται τους πρώτους 2 μήνες ενώ το 90% στους 6 μήνες.

Όταν η θεραπεία για περιπτώσεις ανδρικής υπογονιμότητας αποτύχει συνίσταται η τεχνική σπερματέγχυση:

ΕΞΩΣΩΜΑΤΙΚΗ ΓΟΝΙΜΟΠΟΙΗΣΗ (In vitro Fertilization - IVF) Ωοκυττάρων στο τελικό στάδιο της 2ης μειωτικής πρόφασης που λαμβάνονται με διακολπική αναρρόφηση και υπερηχογραφικό έλεγχο, από τα ώριμα ωοθυλάκια και γονιμοποιούνται σε καλλιέργεια in vitro.

 Η εμβρυομεταφορά γίνεται 2-5 ημέρες μετά την ωοληψία και η ανάπτυξη του εμβρύου κυμαίνεται από το στάδιο των 4 κυττάρων(2η ημέρα ΜΓ) έως τη βλαστοκύστη(5η ημέρα ΜΓ).Οι Steptoe PC και Edwards RG έκαναν την πρώτη εξωσωματική γονιμοποίηση (Steptoe PC, Edwards RG. Birth after the reimplantation of a human embryo. Lancet 1978, ii: 366). Δεν χορήγησαν φάρμακα για την πρόκληση ωορρηξίας.Σήμερα χορηγούνται και GnRH ανάλογα ή αγωνιστές και τα ποσοστά κύησης, συγκρινόμενα με κύκλους διέγερσης ωοθηκών μόνο με χρήση γοναδοτροφινών ή και κιτρικής κλομιφαίνης(ανάλογο του μη στεροειδούς οιστρογόνου chlorotrianisene), έχουν αυξηθεί έως και 25% ανά εμβρυομεταφορά.

* Ενδοωαριακή ένεση σπερματοζωαρίου ή μικρογονιμοποίηση Υποβοηθούμενη εκκόλαψη (Assisted Hatching) δημιουργία πολλαπλών οπών στη ζώνη του προεμβρύου με μηχανικά μέσα ή με ένζυμα βελτιώνεται έτσι η δυνατότητα εμφύτευσης και αυξάνεται η πιθανότητα εγκυμοσύνης.

Ενδοκυτταροπλασματική έγχυση σπερματοζωαρίου (μέθοδος ICSI)

Μικροσκόπιο για εφαρμογή μικρογονιμοποίησης (μεθόδου ICSI)

48 ώρες μετά τη γονιμοποίησηΔιαίρεση 4 κυττάρων

Σπερματοζωάριο

36 ώρες μετά τη γονιμοποίηση του ωαρίου

48-72 ώρες μετά την ωοληψία

Ιστορικό αποτυχίας γονιμοποιήσεως των ωαρίων ή χαμηλό ποσοστό γονιμοποιήσεως σε προηγούμενες προσπάθειες.Το σπέρμα μετά την ειδική επεξεργασία δεν περιέχει περισσότερα από 1 εκατομμύριο κινητά σπερματοζωάριαΠαρατηρείται σοβαρό πρόβλημα συγκόλλησης των σπερματοζωαρίωνΥπάρχει χρόνια φλεγμονή στο σπέρμα που δεν ανταποκρίνεται στη θεραπεία με αντιβιωτικάΓλομποζωοσπερμία: απουσία ακρωσώματος, αδυναμία διάβασης της διαφανούς ζώνης

Δραστηριότητες εργαστηρίου υποβοηθούμενης αναπαραγωγής

Α. ΩοληψίαΕίναι η διαδικασία συλλογής των ωοκυττάρων ΙΙ.Γίνεται στο χειρουργείο σε συνθήκες αποστείρωσης και ασηψίας, με τοπική ή ελαφρά γενική αναισθησία. Πρόκειται για παρακέντηση των ώριμων ωοθυλακίων, με υπερηχογραφική καθοδήγηση, της βελόνας που διαπερνά το τοίχωμα του κόλπου. Στο εργαστήριο, ελέγχεται η λήψη των ωοκυττάρων, τα οποία απομονώνονται από το ωοθυλακικό υγρό και τοποθετούνται σε επωαστικό κλίβανο με ειδικές συνθήκες κυτταρικής καλλιέργειας

Β. Λήψη και επεξεργασία σπέρματοςΕπιδιώκεται η συλλογή και η επεξεργασία του σπέρματος χωρίς επιμολύνσεις ή απώλειες. Για να εκτιμηθεί η επίδραση παραμονής των σπερματοζωαρίων στο περιβάλλον της επιδιδυμίδας ζητούνται δύο δείγματα σπέρματος, μετά απο αποχή δύο και επτά ημερών.Για την επεξεργασία του σπέρματος η μέθοδος επιλέγεται ανάλογα (γόνιμοι και μη γόνιμοι άνδρες) μεταξύ των swim-up, της 24ωρης επιβίωσης και της φυγοκέντρησης σε διάλυμα ασυνεχούς κλίσης πυκνότητας (PureSperm, Percoll).Σκοπός είναι η επιλογή και η συγκέντρωση σε μικρό όγκο των σπερματοζωαρίων με καλή κινητικότητα και τυπική μορφολογία.

Δραστηριότητες εργαστηρίου υποβοηθούμενης αναπαραγωγής

Β1. Παράμετροι κατά την εξέταση του σπέρματοςΕξετάζονται δείγματα σπέρματος που προορίζονται για ενδομήτριο σπερματέγχυση (IUI), εξωσωματική γονιμοποίηση (IVF) και ενδοωαριακή έγχυση σπερματοζωαρίων (ICSI). Η ποιότητα των δειγμάτων IVF είναι καλύτερη από εκείνη των δειγμάτων IUI. Αυτό οφείλεται στο ότι τα δείγματα IVF προέρχονται απο υγιείς άνδρες, δεδομένου ότι σημαντικός αριθμός ζευγαριών προσφεύγει στην IVF λόγω του γυναικείου παράγοντα. Οι κατηγορίες για τις οποίες ευθύνεται ο ανδρικός παράγοντας είναι οι IUI και ICSI.Για τη βασική ανάλυση του σπέρματος, σύμφωνα με τις οδηγίες της WHO (WHO 1999), ελέγχονται: η ρευστοποίηση, το pH, η γλοιότητα και ο όγκος (ml) του σπέρματος καθώς και οι κύριες παράμετροι [ κινητικότητα, μορφολογία (% άτυπες μορφές) και αριθμός των σπερματοζωαρίων (X106/ml)]. Το ποσοστό των κινητών σπερματοζωαρίων εκτιμάται υποκειμενικά στο μικροσκόπιο, σε θερμοκρασία δωματίου. Ο αριθμός τους προσδιορίζεται μετά από μέτρηση στην πλάκα Neubauer improved, βάθους 16μm, σε δύο φάσεις, α) σε μη αραιωμένο δείγμα και β) σε αραιωμένο με PBS δείγμα, μετά τη φυγοκέντρηση και βάσει του τύπου:Μέσος αριθμός κυττάρων X αραίωση X 16 X 104. Η μορφολογία εκτιμάται σε μη αραιωμένο δείγμα όπως επίσης και σε επιχρίσματα σπέρματος χρωματισμένα κατά Παπανικολάου.

Β2. Προετοιμασία των δειγμάτων του σπέρματοςα) Δείγματα από γόνιμους δότες-Swim-upΟγκος σπέρματος 1ml απο κάθε δείγμα διαλύεται 1~2 σε υλικό Earle’s και φυγοκεντρείται για 10 min σε 300 g. Απορρίπτεται το υπερκείμενο και επί του ιζήματος τοποθετείται 0,5 υλικού Earle’s. Το δείγμα διατηρείται σε 37οC και σε ατμόσφαιρα CO2 για 30 min έως 2 ώρες, για τη μετανάστευση των σπερματοζωαρίων. Μετά το τέλος της μετανάστευσης αναρροφάται το υπερκείμενο και εξετάζεται το ίζημα ως προς τη μορφολογία και την απόπτωση.-24ωρη επιβίωσηΕξετάζεται το ποσοστό των ζωντανών κυττάρων σε δύο δείγματα, πριν και μετά από επώαση 24 ωρών σε 37οC. Μετά τη ρευστοποίηση, το πρώτο δείγμα εξετάζεται αμέσως ενώ το δεύτερο μετά απο 24 ώρες. 50 μl σπέρματος διαλύονται σε 400ml PBS που περιέχει 4mg/ml BSA (κλάσμα V) και propidium iodide σε τελική συγκέντρωση 5 μg/ml. Τα δείγματα παραμένουν σε σκοτεινό θάλαμο για 5 min και εν συνεχεία αναλύονται στον κυτταρομετρητή ροής. Εκτιμώνται περίπου 5000 σπερματοζωάρια και το ποσοστό αυτών που δεν χρωματίζονται με το propidium iodide χαρακτηρίζεται ως ζωντανός πληθυσμός.

β) Δείγματα από υπογόνιμους δότεςΑκολουθείται η μέθοδος φυγοκέντρησης του σπέρματος σε διάλυμα ασυνεχούς κλίσης πυκνότητας PureSperm (80-40% Nicadon International AB, Gothenburg, Sweden), προκειμένου να αποκλειστούν οι ανώμαλες μορφές των σπερματοζωαρίων. Από το ρευστοποιημένο δείγμα λαμβάνονται 2ml τα οποία τοποθετούνται στην επιφάνεια του διαλύματος και μετά τη φυγοκέντρηση (20 min σε 250g) αφαιρείται το υπερκείμενο και επί του ιζήματος προστίθεται καλλιεργητικό υλικό. Ακολουθεί δεύτερη φυγοκέντρηση (5 min σε 250g) και στο τελικό ίζημα προστίθεται εκ νέου καλλιεργητικό υλικό και χρησιμοποιείται για την περαιτέρω ανάλυση.

Πρόκειται για τη γενετική ανάλυση ενός ή δύο κυττάρων από το έμβρυο, πριν από την εμφύτευση του στο ενδομήτριο. Τα κοκκιώδη κύτταρα αφαιρούνται προσεκτικά για να μην γίνει επιμόλυνση των εμβρυϊκών με μητρικά κύτταρα.

Προεμφυτευτική γενετική διάγνωση (βιοψία του εμβρύου) - PGD

Πρόκειται για τη διάνοιξη οπής στη διαφανή ζώνη που περιβάλλει το ωοκύτταρο ή το έμβρυο, μέχρι το στάδιο της βλαστοκύστης. Γίνεται με μηχανικό (partial zona dissection, PZD) ή χημικό (zona drilling). Συνηθέστερη είναι η χρήση όξινου διαλύματος Tyrode, που ενίεται τοπικά, στη διαφανή ζώνη. Έχει, επίσης, προταθεί και χρήση Laser. Η μέθοδος εφαρμόζεται εύκολα και το μέγεθος της οπής ελέγχεται με μεγάλη ακρίβεια.

Το πρώτο πολικό σωμάτιο πρέπει να αναρροφάτε εντός διαστήματος 6 ωρών από της ωοληψίας, δεδομένου ότι μετά εκφυλίζεται. Το δεύτερο, λαμβάνεται από το ζυγώτη. Η βιοψία γίνεται με πιπέττα εσωτερικής διαμέτρου 20mμ με ακανθωτό ρύγχος, για τη μηχανική διάτριση της διαφανούς ζώνης.

Γίνεται συνήθως το πρωϊ της τρίτης ημέρας της ανάπτυξης (ως πρώτης ημέρας θεωρούμενης αυτής του σχηματισμού του ζυγώτη) όταν το έμβρυο αποτελείται από 6-10 βλαστομερίδια. Η βιοψία περιλαμβάνει δύο στάδια: τη διάνοιξη της διαφανούς ζώνης και τη λήψη των βλαστομεριδίων.

Ένα πρόβλημα που παρατηρείται κατά τη βιοψία του εμβρύου είναι ότι στο στάδιο αυτό της αυλάκωσης αρχίζει η διεργασία της σύμπηξης (compaction) των βλαστομεριδίων, γεγονός που καθιστά δύσκολη την εμβρυοληψία, επειδή τα βλαστομερίδια αναπτύσσουν μεταξύ τους δεσμούς σύνδεσης. Για το λόγο αυτό έχει προταθεί η χρησιμοποίηση ειδικού καλλιεργητικού υλικού, το οποίο δεν περιέχει Ca2+ και Mg2+ έτσι ώστε να χαλαρώνουν οι συνδέσεις και να γίνεται εύκολα η λήψη των βλαστομεριδίων

Οι βιοψίες που γίνονται νωρίτερα, στο στάδιο των 4 κυττάρων, είναι πιθανόν να αλλοιώσουν την αναλογία των κυττάρων της εσωτερικής κυτταρικής μάζας προς τα κύτταρα της τροφοβλάστης, γεγονός που μπορεί να είναι μοιραίο για την περαιτέρω ανάπτυξη του εμβρύου. Συνήθως, η βιοψία γίνεται στο στάδιο των 6-10 κυττάρων, την 3η ημέρα μετά τη γονιμοποίηση και μπορεί να ληφθεί το 25% του εμβρύου. Το αποτέλεσμα εκφράζεται σε επιτυχείς κυήσεις, μετά από βιοψία εμβρύου και PGD. Οι βιοχημικές εξετάσεις και οι μετρήσεις με υπερήχους δείχνουν ότι δεν υπάρχουν διαφορές στην ανάπτυξη του κυήματος, σε σύγκριση με τους μάρτυρες ενώ ο τοκετός, είναι φυσιολογικός. Έχει γίνει πολλή συζήτηση για το αν θα πρέπει να λαμβάνονται ένα ή δύο βλαστομερίδια κατά τη βιοψία του εμβρύου, επειδή πιστεύεται ότι η βιοψία δύο βλαστομεριδίων μπορεί να επηρεάσει την ικανότητα εμφύτευσης του εμβρύου.

Για τον έλεγχο του φύλου και την ανάλυση των ανευπλοειδιών σε γυναίκες μεγαλύτερης ηλικίας ένα βλαστομερίδιο είναι αρκετό. Για χρωμοσωμικές ανωμαλίες πρέπει να εξετάζονται 2 κύτταρα λόγω του μωσαϊκισμού που παρατηρείται και μπορεί να οδηγήσει σε εσφαλμένη διάγνωση. Για τα υπολειπόμενα νοσήματα, ένα βλαστομερίδιο είναι, πιθανώς, αρκετό (ειδικότερα όταν χρησιμοποιούνται δείκτες για τον έλεγχο της επιμόλυνσης) αλλά για τα κυρίαρχα νοσήματα, πιθανώς, να χρειάζονται δύο βλαστομερίδια.

Τα τελευταία χρόνια πολλά κέντρα εξωσωματικής γονιμοποίησης έχουν αναφέρει ότι η καλλιέργεια των εμβρύων μέχρι το στάδιο της βλαστοκύστης βελτιώνει τα ποσοστά των κυήσεων σε ορισμένες κατηγορίες γυναικών. Ωστόσο, μόνο 40% των εμβρύων φθάνουν στο στάδιο της βλαστοκύστης in vitro. Τα υπόλοιπα σταματούν την εξέλιξή τους και εκφυλίζονται. Aπό την κοινοπραξία ESHRE PGD (Ευρωπαϊκή Εταιρεία Ανθρώπινης Αναπαραγωγής και Εμβρυολογίας, PGD Consortium, 1999) έχει ανακοινωθεί ότι από τα 4837 ωοκύτταρα μετά την ωοληψία μόνο 919 θεωρήθηκαν κατάλληλα για εμβρυομεταφορά μετά την PGD.

Ρωξάνη Αγγελοπούλου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια
Εργαστήριο Ιστολογίας και Εμβρυολογίας
Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών
Τελευταία αναθεώρηση : 1/10/2006