2.1 ΒΙΟΜΟΡΙΑΚΗ ΤΑΥΤΟΤΗΤΑ ΑΔΡΑΝΟΠΟΙΗΣΗΣ - ΚΑΝΟΝΕΣ ΚΑΙ ΕΞΑΙΡΕΣΕΙΣ

ΓΕΝΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΟΥ ΦΑΙΝΟΜΕΝΟΥ.

Α. Δομή της χρωματίνης του αδρανοποιημένου Χ χρωμοσώματος.

Η παρουσία δυο Χ χρωμοσωμάτων στα φυσιολογικά θηλυκά άτομα (μιλώντας πάντα για τον άνθρωπο) και ενός μόνο Χ χρωμοσώματος στα φυσιολογικά αρσενικά άτομα είναι μοναδική σε σύγκριση με τους ίσους αριθμούς αυτοσωμάτων παρόντων στους πυρήνες των κυττάρων και των δυο φύλων. Θεωρητικά και μόνο, θα μπορούσαμε να υποθέσουμε ότι αυτή η διαφορά θα μπορούσε να δημιουργήσει ένα πρόβλημα «γενετικής δόσης» μεταξύ των αρσενικών και θηλυκών ατόμων όσον αφορά στα γονίδια που εδράζονται στο Χ χρωμόσωμα, από τη στιγμή που τα θηλυκά άτομα έχουν δυο αντίγραφα για κάθε γονίδιο ενώ τα αρσενικά μόνο ένα. Συνεπώς, υπάρχει δυνατότητα παραγωγής διπλάσιας ποσότητας από το γονιδιακό προϊόν καθενός γονιδίου του Χ χρωμοσώματος.

Οι έρευνες και τα πειράματα των Murray L. Barr και Ewart G. Bertram σε θηλυκές γάτες και οι επακόλουθες μελέτες των Keith Moore και Barr σε ανθρώπους επιδεικνύουν ένα γενετικό μηχανισμό στα θηλαστικά που εξισορροπεί τη δόση των γονιδιακών προϊόντων του Χ χρωμοσώματος σε θηλυκά και αρσενικά άτομα. Πρόκειται για την αδρανοποίηση του ενός από τα δύο Χ χρωμοσώματα των θηλυκών ατόμων, η οποία έχει ως αποτέλεσμα η δόση της γενετικής πληροφορίας που εκφράζεται στα θηλυκά και τα αρσενικά άτομα να είναι ισότιμη.

Οι Barr και Bertram παρατήρησαν ότι το αδρανοποιημένο Χ χρωμόσωμα, το οποίο ονόμασαν σωμάτιο Barr (Barr body), εμφανίζεται στο μεσοφασικό πυρήνα των κυττάρων των θηλαστικών. Το αδρανές Χ εμφανίζεται με τη μορφή της ετεροχρωματίνης. Ως γνωστόν, το DNA ενός μεσοφασικού πυρήνα ευκαρυωτικού κυττάρου εμφανίζεται με δυο μορφές, με κριτήριο το βαθμό συμπύκνωσης. Η περισσότερο συμπυκνωμένη μορφή της χρωματίνης στη μεσόφαση είναι η ετεροχρωματίνη. Αρχικά παρατηρήθηκε με το φωτονικό μικροσκόπιο με την μορφή ευδιάκριτων βαθυχρωματικών περιοχών μέσα στη μάζα της χρωματίνης. Η ετεροχρωματίνη είναι μεταγραφικά ανενεργή και εντοπίζεται στο κεντρομερίδιο και στα άκρα των χρωμοσωμάτων. Ο βαθμός συμπύκνωσης δεν αλλάζει πολύ κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου.

Η ετεροχρωματίνη διακρίνεται σε:

• Συστατική (Constitutive): πρόκειται για περιοχές που δεν εκφράζονται (δορυφορικό DNA) και τυπικά συγκεντρώνονται γύρω από το κεντρομερίδιο.
• Λειτουργική (Facultative): πρόκειται για σχεδόν ολόκληρα χρωμοσώματα αδρανή σε μια κυτταρική σειρά, που μπορούν όμως να εκφραστούν σε άλλες κυτταρικές σειρές.

Η λιγότερο συμπυκνωμένη μορφή της χρωματίνης κατά τη μεσόφαση είναι η ευχρωματίνη και αφορά σε περιοχές μεταγραφικά ενεργές. Συνεπώς, το αδρανοποιημένο Χ χρωμόσωμα βρίσκεται σε καταστολή της έκφρασης των γονιδίων του, λόγω της συμπύκνωσής του.

Το αδρανές Χ χρωμόσωμα εμφανίζεται πολύ σφιχτά πακεταρισμένο, με αποτέλεσμα στο μικροσκόπιο να είναι ορατό ως ένα διακριτό σκοτεινό στοιχείο στο μεσοφασικό πυρήνα κυττάρων θηλυκών θηλαστικών, με διάμετρο 1 μm περίπου, διπλωμένο σαν φουρκέτα και προσκολλημένο στην εσωτερική επιφάνεια της πυρηνικής μεμβράνης (Εικόνα 2.1.1). Στην κατάσταση αυτή, το DNA του αδρανούς Χ έχει πολύ λίγες θέσεις υπερευαισθησίας στη DNAse I, δηλαδή θέσεις που μπορεί να δράσει το ένζυμο DNAse I και να τεμαχίσει το DNA.

Β. Ο κανόνας Χ-1.

Στους πυρήνες των κυττάρων φυσιολογικών θηλυκών θηλαστικών περιέχεται 1 σωμάτιο Barr ενώ στους πυρήνες των κυττάρων φυσιολογικών αρσενικών ατόμων δεν υπάρχει σωμάτιο Barr. Επίσης, επιχρίσματα κυττάρων με ανωμαλίες στον αριθμό των Χ χρωμοσωμάτων έδειξαν ότι:

• Σε θηλυκά άτομα με σύνδρομο Turner (45,Χ) δεν υπάρχει σωμάτιο Barr στον πυρήνα των κυττάρων τους.
• Σε αρσενικά άτομα με σύνδρομο Kleinefelter (47,ΧΧΥ) υπάρχει 1 σωμάτιο Barr.
• Επιπλέον, θηλυκά άτομα με καρυότυπο 47,ΧΧΧ έχουν 2 σωμάτια Barr και θηλυκά με 48,ΧΧΧΧ έχουν 3 σωμάτια Barr κ.ο.κ.

Βλέπουμε, λοιπόν, πως για τον αριθμό των σωματίων Barr στον πυρήνα ενός κυττάρου ισχύει ο κανόνας Χ-1, δηλαδή ο αριθμός των σωματίων Barr θα είναι ίσος με Χ-1, όπου Χ ο αριθμός των παρόντων στον πυρήνα Χ χρωμοσωμάτων.

Η ισχύς του κανόνα αυτού είναι γενική. Συνεπώς, ο αριθμός των σωματίων Barr σε ένα φυσιολογικό ή μη κύτταρο θηλυκού ( ή ακόμα και αρσενικού σύμφωνα με τα παραπάνω) θα είναι ίσος με X-1. (Εικ. 2.1.2)

Υπάρχουν θεωρίες που υποστηρίζουν την ύπαρξη ενός ανασταλτικού παράγοντα (blocking factor) που παράγεται από το κύτταρο σε περιορισμένη ποσότητα η οποία όμως είναι επαρκής για την πρόσδεση του στο ένα από τα δύο κέντρα αδρανοποίησης (XIC:X inactivation center) στα διπλοειδή κύτταρα. Βέβαια, τίποτα ακόμα δεν έχει αποδειχθεί για την ύπαρξη ενός τέτοιου μηχανισμού που «μετράει» τα υπάρχοντα Χ χρωμοσώματα. Συνεπώς, το κύτταρο φροντίζει να διατηρεί σε ενεργό μορφή ένα Χ χρωμόσωμα, ανεξάρτητα από το συνολικό αριθμό των Χ χρωμοσωμάτων που είναι παρόντα στον πυρήνα του κυττάρου.

Γ. Αντιγραφή του αδρανοποιημένου Χ χρωμοσώματος.

Η ετεροχρωματίνη του αδρανοποιημένου Χ, που όπως προαναφέρθηκε είναι μεταγραφικά ανενεργή, καθυστερεί στο διπλασιασμό του DNA της σε σύγκριση με το ενεργό χρωμόσωμα Χ. Συγκεκριμένα, η ετεροχρωματίνη του σωματίου Barr παραμένει πολύ συμπυκνωμένη στη μεσόφαση και συνεπώς δε μεταγράφεται. Στη φάση S του κυτταρικού κύκλου που είναι η φάση διπλασιασμού του DNA, το δραστικό Χ αντιγράφεται πολύ αργά, λίγο πριν το τέλος της φάσης S. Το γεγονός αυτό, το οποίο είναι καθολικό για την ετεροχρωματίνη και την ευχρωματίνη του πυρήνα, αποδεικνύει πως ο χρόνος διπλασιασμού της χρωματίνης εξαρτάται από το βαθμό συμπύκνωσης της.

Η διαφορά αυτή, ή αλλιώς η καθυστέρηση στην αντιγραφή των δυο Χ χρωμοσωμάτων οφείλεται φυσικά στη διαφορετική συμπύκνωση τους καθώς το μεν δραστικό Χ συνδέεται χαλαρά με την ιστόνη Η1 ενώ το δε αδρανές συνδέεται ισχυρά με τα μόρια της ιστόνης αυτής. ( Να σημειωθεί ότι η ιστόνη Η1 είναι αυτή που παρεμβάλλεται μεταξύ των νουκλεοσωμάτων στο DNA και συμβάλλει στην αύξηση συσπείρωσης της δομής του DNA). Επιπλέον, το δραστικό Χ εμφανίζει και υπερακετυλίωση των τεσσάρων τύπων νουκλεοσωματικών ιστονών (δηλ της Η2Α, Η2Β, Η3, Η4).

Η ακετυλίωση συνίσταται στην προσθήκη ακετυλομάδων στα μόρια των ιστονών. Υπάρχουν πολλά ένζυμα για αυτή την επεξεργασία των ιστονών, που ονομάζονται ακετυλοτρανσφεράσες. Η ακετυλίωση επηρεάζει τη δομή της χρωματίνης. Πιο αναλυτικά, η ακετυλίωση «ανοίγει» τη χρωματίνη, δηλαδή την καθιστά μεταγραφικά πιο ενεργή και παρατηρείται σε ενεργά γονίδια με θέσεις υπερευαισθησίας στη DNAse I. Αντίθετα, η υποακετυλίωση συμπυκνώνει τη χρωματίνη, περιορίζει την έκφραση των γονιδίων και παρατηρείται σε μεταγραφικά ανενεργές περιοχές. Από αυτά γίνεται σαφές ότι η υποακετυλίωση των ιστονών του αδρανούς Χ είναι απαραίτητη για την καταστολή της έκφρασης των γονιδίων του.

Μια δυσλειτουργία του ενζύμου ακετυλοτρανσφεράση στο ποντίκι και στον άνθρωπο έχει ως αποτέλεσμα το αδρανές Χ χρωμόσωμα και η περικεντρική ετεροχρωματίνη των υπολοίπων χρωμοσωμάτων να στερούνται ακετυλιωμένων ισομορφών των ιστονών Η2Α, Η3 και Η4.

Στους εξωεμβρυϊκούς ιστούς του ποντικού αδρανοποιείται το Χ πατρικής προέλευσης επιλεκτικά. Το αδρανές Χπ στους ιστούς αυτούς δεν εμφανίζει το πρότυπο της καθυστερημένης αντιγραφής που ακολουθείται από τα κύτταρα της εμβρυϊκής σειράς. Αντίθετα, αντιγράφεται νωρίτερα από τα αυτοσώματα και το ενεργό Χμ. Επίσης, υπάρχουν τοπικές διαφορές στη σταθερότητα του προτύπου της πρώιμης αντιγραφής και σε μερικούς ιστούς της εξωεμβρυϊκής σειράς όπου το αδρανές Χπ αντιγράφεται αργότερα. Η σημασία αυτών των ευρημάτων δεν είναι κατανοητή αλλά μπορεί να υποδεικνύει ένα διαφορετικό μηχανισμό αδρανοποίησης του Χ χρωμοσώματος στους εξωεμβρυϊκούς ιστούς από αυτόν των εμβρυϊκών κυττάρων σειρών.

Δ. Μεθυλίωση και αδρανοποίηση.

Όπως αναφέρθηκε πιο πριν, τα γονίδια του αδρανούς Χ βρίσκονται σε μεταγραφική καταστολή. Σε αυτό συντελεί όχι μόνο η υποακετυλίωση των ιστονών αλλά και η μεθυλίωση του DNA.

Η μεθυλίωση συμβαίνει στις νησίδες CpG. Οι νησίδες CpG είναι μικρά τμήματα DNA, μήκους 1-2 kb στα οποία η συχνότητα του δινουκλεοτιδίου CpG, (C συνδεόμενη με G με 3΄-5΄ φωσφοδιεστερικό δεσμό), είναι ίση με το συνολικό περιεχόμενο του DNA σε CG.

Η επίδραση της μεθυλίωσης στη μεταγραφική δραστηριότητα των γονιδίων στο Χ, (ως Χα από εδώ και πέρα θα εννοείται το αδρανές Χ χρωμόσωμα), φαίνεται με τη σύγκριση των γονιδίων του αδρανούς και του δραστικού Χ χρωμοσώματος. Για παράδειγμα 60 από τα 61 δινουκλεοτίδια CpG στις νησίδες CpG που βρίσκονται γύρω από τον υποκινητή του γονιδίου PGK1 (το γονίδιο αυτό παράγει το ένζυμο φωσφογλυκερολική κινάση και η απουσία του προκαλεί αιμολυτική αναιμία), έχουν μεθυλιωμένη C στο Χα. Αντίθετα, στο δραστικό Χ οι περιοχές αυτές είναι υπομεθυλιωμένες και μεταγράφονται κανονικά. Επιπλέον, κατεργασία με 5-aza-κυτιδίνη οδηγεί σε απομεθυλίωση του DNA και μπορεί να ενεργοποιήσει τα αδρανή γονίδια του Χα.

Μόνο το 3% των C του ανθρώπινου DNA είναι μεθυλιωμένες και ο περισσότερες βρίσκονται σε δινουκλεοτίδια CpG. Πειράματα δείχνουν πως η C είναι υπομεθυλιωμένη σε γονίδια που εμφανίζουν ιστική εξειδίκευση και υπερμεθυλιωμένη στα κύτταρα των ιστών όπου το γονίδιο αυτό δεν εκφράζεται.

De novo μεθυλίωση των νησίδων CpG κατά την ανάπτυξη μπορεί να επηρεάσει τη μεταγραφή των σχετιζομένων γονιδίων. Υπάρχουν στοιχεία που δείχνουν ότι η μεθυλίωση της C σχετίζεται με την ετεροχρωματινοποίηση του Χ χρωμοσώματος και συγκεκριμένα συμβαίνει μετά από αυτήν.

Να σημειωθεί και πάλι ότι οι ομόλογες περιοχές στο δραστικό Χ είναι υπομεθυλιωμένες.

Σε ορισμένες περιπτώσεις, η μεθυλίωση των θέσεων CpG στο αδρανοποιημένο Χ είναι δυνατόν να μεταβάλλεται. Υπάρχουν, όμως, ορισμένες θέσεις – κλειδιά των οποίων η μεθυλίωση συνοδεύεται πάντοτε από αδρανοποίηση. Άρα μεταβολή στις μεθυλιωμένες θέσεις δεν επηρεάζει σημαντικά την καταστολή της έκφρασης του Χα από τη στιγμή που δεν επηρεάζονται αυτές οι θέσεις-κλειδιά.

Ε. Εμφάνιση του Χα.

Στον άνθρωπο, το Χα εμφανίζεται περίπου τη 16η μέρα μετά τη γονιμοποίηση λίγο μετά την εμφύτευση της βλαστοκύστης.

Στο ποντίκι, με μελέτες που αφορούν στη δραστηριότητα του ενζύμου G6PD (το γονίδιο του ενζύμου αυτού εδράζεται στο Χ χρωμόσωμα) καθορίστηκαν οι βαθμίδες αδρανοποίησης του Χ στους εμβρυϊκούς και τους εξωεμβρυϊκούς ιστούς από το στάδιο της βλαστοκύστης μέχρι το στάδιο του γαστριδίου. Όταν μιλάμε για εξωεμβρυϊκούς ιστούς εννοούμε τον πλακούντα, τον αμνιακό σάκο, το τροφοεξώδερμα και την αλλαντοϊδα.

Πιο συγκεκριμένα, κατά την ωογένεση επανενεργοποιείται το αδρανές Χ και τα ωάρια που προκύπτουν έχουν ενεργά Χ (Χμ) ενώ κατά τη σπερματογένεση το προκύπτον σπερματοζωάριο έχει το μοναδικό του Χ(Χπ) ανενεργό. Αμέσως όμως μετά τη γονιμοποίηση και τα δυο Χ χρωμοσώματα του ζυγωτή είναι ενεργά.

Αρχικά, καθώς ο ζυγωτής πολλαπλασιάζεται συνεχίζει να έχει και τα δυο Χ χρωμοσώματα ενεργά. Στα αρχικά στάδια όμως της βλαστοκύστης (3,5 ημέρες περίπου μετά τη γονιμοποίηση) στην εσωτερική κυτταρική μάζα τα κύτταρα έχουν κα τα δύο Χ ενεργά, ενώ στο τροφοεξώδερμα το Χπ απενεργοποιείται και το Χμ παραμένει ενεργό. Στα τελικά στάδια της βλαστοκύστης (4,5 ημέρες μετά τη γονιμοποίηση) στην εσωτερική κυτταρική μάζα (που έχει αυξηθεί) τα κύτταρα εξακολουθούν να έχουν και τα δύο Χ ενεργά ενώ όλα τα υπόλοιπα κύτταρα έχουν το Χπ αδρανές και το Χμ ενεργό. Στην συνέχεια, η βλαστοκύστη εμφυτεύεται στη μήτρα και στο στάδιο του κυλίνδρου (6 ημέρες) οι εξωεμβρυϊκοί ιστοί περιέχουν κύτταρα με αδρανές το Χπ και ενεργό το Χμ, ενώ στην επιβλάστη υπάρχουν κύτταρα με Χπ αδρανές και Χμ ενεργό και το αντίστροφο, δηλαδή κύτταρα με Χπ δραστικό και Χμ αδρανές.

Τέλος, καθώς το έμβρυο αναπτύσσεται προκύπτουν κλώνοι με ανενεργά Χ διαφορετικής προέλευσης, είτε πατρικής είτε μητρικής. (Εικ. 2.1.3)

Επίσης, η αδρανοποίηση του ενός Χ στα ωογόνια αφορά άλλοτε το Χ μητρικής προέλευσης και άλλοτε το Χ πατρικής προέλευσης.

Στ. Χαρακτηριστικά της αδρανοποίησης σύμφωνα με την υπόθεση Lyon.

Η αδρανοποίηση του Χ χρωμοσώματος στους ιστούς του θηλυκού ατόμου γίνεται τυχαία. Κάθε φορά αδρανοποιείται είτε το Χ μητρικής είτε το Χ πατρικής προσέλευσης. Παρ’ όλα αυτά, υπάρχουν μερικές εξαιρέσεις στις οποίες και θα αναφερθούμε αργότερα.

Η αδρανοποίηση διατηρείται σταθερή, είναι πλήρης (μερικές εξαιρέσεις γονιδίων στις οποίες θα αναφερθούμε εκτενώς αργότερα), είναι μη αντιστρεπτή και μεταδίδεται κατά τις επόμενες κυτταρικές διαιρέσεις στα σωματικά θυγατρικά κύτταρα, με αποτέλεσμα τη δημιουργία κλώνων οι οποίοι περιέχουν σταθερά το ίδιο Χ χρωμόσωμα αδρανοποιημένο. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα, το άτομο να είναι ένα μωσαϊκό μητρικών και πατρικών γονιδίων, δηλαδή τα μισά κύτταρα εκφράζουν τα γονίδια που εδράζονται στο Χ πατρικής προέλευσης και τα άλλα μισά εκφράζουν τα γονίδια που εδράζονται στο Χ μητρικής προέλευσης. (Εικ. 2.1.4)

Αυτό επηρεάζει πολύ το φαινότυπο, ειδικά στις γυναίκες. Σε περίπτωση μεταλλαγμένου γονιδίου στο Χ σε μια γυναίκα ετερόζυγη για το μεταλλαγμένο γονίδιο, τα μισά της κύτταρα θα εκφράζουν το φυσιολογικό γονίδιο ενώ τα άλλα μισά θα εκφράζουν το μεταλλαγμένο. Συνεπώς, τα κύτταρα ΧΧ είναι λειτουργικά μωσαϊκά για τους χαρακτήρες που φέρουν στην ετερόζυγη κατάσταση.

Υπάρχουν πολλά παραδείγματα φαινότυπου μωσαϊκισμού στα θηλυκά. Στα ποντίκια, το χρώμα του τριχώματος καθορίζεται από ένα γονίδιο στο Χ. Στα ετερόζυγα θηλυκά υπάρχουν περιοχές στο τρίχωμα τους με το χρώμα που καθορίζεται από το ένα αλληλόμορφο και περιοχές που εκφράζουν το χρώμα που καθορίζεται από το άλλο αλληλόμορφο (Εικ.2.1.5).

Άλλο παράδειγμα είναι η παρουσία ή μη κηλίδων στον αμφιβληστροειδή χιτώνα του οφθαλμού ετερόζυγων γυναικών, γεγονός που υποδηλώνει την τυχαία αδρανοποίηση του γονιδίου του αλφισμού. Ένα τελευταίο παράδειγμα αφορά στην αχρωματοψία στο πράσινο πράσινο-κόκκινο. Τα ημίζυγα αρσενικά έχουν πλήρη έλλειψη αντίληψης του πράσινου και του κόκκινου σε όλα τα αμφιβληστροειδικά τους κύτταρα, ενώ τα θηλυκά ετερόζυγα εμφανίζουν μωσαϊκά αμφιβληστροειδικά κύτταρα με περιοχές με προβληματική αντίληψη των χρωμάτων αυτών ενώ γύρω τους υπάρχουν περιοχές με κανονική αντίληψη των χρωμάτων.

Γενικά, τα κύτταρα που εκφράζουν το Χμ και αυτά που εκφράζουν το Χπ είναι κατανεμημένα σε κυστίδια στον ενήλικο, αντικατοπτρίζοντας κατά αυτόν τον τρόπο την τάση των θυγατρικών κυττάρων να παραμένουν κοντινοί γείτονες κατά τα επόμενα στάδια της ανάπτυξης.

Ζ. Η διαδικασία της αδρανοποίησης του Χ χρωμοσώματος στα εμβρυϊκά, τα σωματικά και τα γεννητικά κύτταρα.

Υπάρχει μια μοναδική και παράλληλα φυσιολογική εξαίρεση της σταθερότητας του αδρανοποιημένου Χ χρωμοσώματος. Πρόκειται για την επανενεργοποίηση του αδρανούς Χ στα ωογόνια του ποντικού 12,5 με 13,5 ημέρες μετά τη γονιμοποίηση. Η αντιστροφή αυτή στην ανενεργό κατάσταση του Χα κρίνεται απαραίτητη ώστε να επιτευχθεί η φυσιολογική σύζευξη των χρωμοσωμάτων κατά την ωορρηξία και τη γονιμοποίηση. Έτσι, το Χ παραμένει δραστικό κατά την ωορρηξία και τη γονιμοποίηση και χάνει την δραστικότητα του μετά τη γονιμοποίηση λίγο πριν την εμφύτευση της βλαστοκύστης.

Στα σπερματογόνια, το μοναδικό Χ χρωμόσωμα συμπυκνώνεται λίγο πριν εισέλθει στην πρόφαση της πρώτης μειωτικής διαίρεσης, αφού πρώτα έχει διπλασιαστεί στο τέλος της φάσης S και συνδυάζεται με το Υ χρωμόσωμα το οποίο βρίσκεται επίσης σε συμπυκνωμένη μορφή. Και τα δύο βρίσκονται σε μεταγραφική καταστολή και εντοπίζονται μέσα στο φυλετικό κυστίδιο το οποίο εντοπίζεται κοντά στην πυρηνική μεμβράνη. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται η αποφυγή της σύζευξης και ο ανασυνδυασμός μεταξύ μη ομόλογων χρωμοσωμικών περιοχών. Βλέπουμε, λοιπόν, πως το Χ χρωμόσωμα δεν είναι μεταγραφικά ενεργό κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης και μετά το πέρας της γονιμοποίησης παρά το γεγονός ότι τα αυτοσώματα παραμένουν μεταγραφικά ενεργά πριν και μετά τη μείωση (Εικ. 2.1.6).

Γεννιέται όμως το ερώτημα πως καταφέρνουν τα σπερματοκύτταρα και οι σπερματίδες να έχουν επαρκείς ποσότητες ενζύμων τα οποία παράγονται από γονίδια που εδράζονται στο Χ, αφού αυτό βρίσκεται σε μεταγραφική καταστολή. Μια πιθανή απάντηση είναι να βρίσκονται στο κύτταρο είτε αποθηκευμένες ήδη μεταφρασμένες πρωτεΐνες ή ένζυμα είτε αποθηκευμένα σταθερά μετάγραφα mRNA των γονιδίων αυτών τα οποία μεταφράζονται αργότερα ανάλογα με τις ανάγκες του κυττάρου.

Ο κύκλος αυτός αδρανοποίησης και ενεργοποίησης του Χ χρωμοσώματος είναι συμβατός με τις ανάγκες σύζευξης και γενετικού ανασυνδυασμού και παρατηρείται μια άριστη συσχέτιση της μεταγραφικής δραστηριότητας και της ικανότητας των χρωμοσωμάτων να συζεύγνυνται.

ΕΞΑΙΡΕΣΕΙΣ ΤΗΣ ΤΥΧΑΙΑΣ ΑΔΡΑΝΟΠΟΙΗΣΗΣ ΚΑΙ ΓΟΝΙΔΙΑ ΠΟΥ ΔΙΑΦΕΥΓΟΥΝ ΤΗΣ ΑΔΡΑΝΟΠΟΙΗΣΗΣ.

Α. Εξαιρέσεις της τυχαίας αδρανοποίησης λόγω δομικών ή αριθμητικών ανωμαλιών του Χ χρωμοσώματος.

Παρά το τυχαίο της αδρανοποίησης που υποστήριξε η Mary Lyon στην υπόθεση της το 1961, υπάρχουν κάποιες περιπτώσεις, οι οποίες αποτελούν παθολογικές καταστάσεις στις οποίες λόγω ύπαρξης ανωμαλιών στο Χ ακολουθείται ένα πρότυπο αδρανοποίησης, διαφορετικό κάθε φορά.

Οι περιπτώσεις αυτές αναλυτικά είναι:

1. Στις ανωμαλίες του αριθμού των Χ χρωμοσωμάτων, όπως αναφέρθηκε και στην αρχή της ενότητας, ακολουθείται πιστά ο κανόνας Χ-1, οπότε παραμένει δραστικό ένα μόνο Χ ανεξάρτητα από το συνολικό τους αριθμό (Εικ. 2.1.7).

2. Στις δομικές ανωμαλίες του Χ, αδρανοποιείται το ανώμαλο Χ, με αποτέλεσμα οι ανωμαλίες να γίνονται καλύτερα ανεκτές σε σύγκριση με τα αυτοσώματα, γιατί στην περίπτωση των αυτοσωμάτων το ανώμαλο αυτόσωμα παραμένει ενεργό δημιουργώντας παθολογικές συνέπειες για το κύτταρο.

3. Στις περιπτώσεις μεταθέσεων μεταξύ αυτοσωμάτων και του Χ, επιλέγεται η κατάσταση με τις λιγότερες συνέπειες στο φαινότυπο. Συγκεκριμένα:

i. Όταν έχουμε ισόρροπη μετάθεση, δηλαδή όταν κάποιο τμήμα του Χ χρωμοσώματος μετατοπιστεί αμοιβαία με τμήμα ενός αυτοσώματος, τότε η λιγότερη επώδυνη λύση είναι η αδρανοποίηση του φυσιολογικού Χ χρωμοσώματος, στο 90% των περιπτώσεων. Το κύτταρο επιλέγει αυτήν την οδό, γιατί σε περίπτωση που αδρανοποιούσε το μετατοπισμένο τμήμα του Χ, τότε η αδρανοποίηση θα επεκτεινόταν και στο αυτόσωμα. Αυτό σημαίνει έλλειψη των γονιδιακών προϊόντων του αυτοσώματος με μοιραίες συνέπειες για το κύτταρο και συνεπώς τον οργανισμό (Εικ. 2.1.8).

ii. Όταν έχουμε μη ισόρροπη μετάθεση κατά την οποία υπάρχει απώλεια γενετικού υλικού αδρανοποιείται το τμήμα του Χ χρωμοσώματος που έχει μετατεθεί. Τότε, όμως η αδρανοποίηση εξαπλώνεται και στο αυτόσωμα οπότε στο φαινότυπο παρατηρούνται δυσμορφία και πνευματική καθυστέρηση

iii. Στην περίπτωση του ισοχρωμοσώματος, αδρανοποιείται το ανώμαλο Χ χρωμόσωμα. Τα ισοχρωμοσώματα προκύπτουν από τον άτυπο διαχωρισμό του κεντρομεριδίου και καταλήγουν είτε σε διπλασιασμό του μικρού βραχίονα και έλλειψη του μεγάλου βραχίονα (ISOp), είτε σε διπλασιασμό του μεγάλου βραχίονα και έλλειψη του μικρού βραχίονα (ISOp) (Εικ. 2.1.9).

4. Τέλος, έχει παρατηρηθεί στους διδύμους το φαινόμενο του κατόπτρου κατά το οποίο αν ο ένας προσβληθεί από μυϊκή δυσφορία (ασθένεια που οφείλεται σε γονίδιο που εδράζεται στο Χ χρωμόσωμα), τότε ο άλλος δεν θα προσβληθεί ποτέ.

Β. Γονίδια που διαφεύγουν της αδρανοποίησης

Η Mary Lyon στην υπόθεση της για την αδρανοποίηση του Χ χρωμοσώματος πρότεινε ότι αυτή είναι πλήρης, ότι δηλαδή όλα τα γονίδια που εδράζονται στο Χ καταστέλλονται μεταγραφικά.

Υπάρχουν, όμως, ενδείξεις ότι η αδρανοποίηση δεν είναι πλήρης. Συγκεκριμένα, 1 στα 600 αγόρια γεννιούνται με δυο Χ χρωμοσώματα και ένα Υ. Αυτά τα άτομα παρουσιάζουν ένα τυπικό σύνολο ανωμαλιών στο φαινότυπο, γνωστό ως σύνδρομο Kleinefelter. Συνήθως, τα άτομα αυτά έχουν μακριά άκρα και είναι στείρα. Παρ’ όλα αυτά, η κατάσταση αυτή δεν οδηγεί σε σωματικές ανωμαλίες. Πολλά άτομα φαινοτυπικά υγιή έχουν βρεθεί με αυτή τη χρωμοσωματική σύσταση, παρ’ ότι είναι ενίοτε στείρα.

Όπως αναμένεται, τα άτομα με σύνδρομο Kleinefelter έχουν ένα σωμάτιο Barr, δηλαδή ένα από τα δύο Χ έχει αδρανοποιηθεί. Αν η αδρανοποίηση ήταν πλήρης, τότε θα έπρεπε να περιμένουμε ότι τα άτομα αυτά θα ήταν απολύτως φυσιολογικά καθώς σε όλα τους τα κύτταρα θα είχαν σε ενεργότητα μόνο το ένα Χ χρωμόσωμα. Το γεγονός ότι δεν είναι φυσιολογικά και ότι είναι σταθερά στείρα δείχνει ότι θα πρέπει να υπάρχει κάποια τοπική δραστηριότητα του αδρανούς Χ με επιβλαβή ανευπλοειδικά αποτελέσματα.

Παρόμοια, περίπου 1 στα 2000 κορίτσια γεννιούνται με ένα μόνο χρωμόσωμα Χ (ΧΟ). Αυτές οι γυναίκες συχνά χαρακτηρίζονται από χαμηλό ύψος και έλλειψη δευτερογενών χαρακτηριστικών του φύλου. Το σύνδρομο αυτό ονομάζεται σύνδρομο Tuner. Τα θηλυκά αυτά, όπως και τα φυσιολογικά αρσενικά, δεν έχουν σωμάτιο Barr. Και πάλι, το γεγονός ότι είναι στείρες και δείχνουν ένα τυπικό σύνολο ανωμαλιών είναι ενδεικτικό ότι πρέπει να υπάρχει κάποια δραστικότητα του δεύτερου Χ χρωμοσώματος, το οποίο σε αυτήν την περίπτωση απουσιάζει.

Μια τρίτη κοινή ανωμαλία είναι το σύνδρομο του τριπλού Χ χρωμοσώματος. Τα άτομα που πάσχουν έχουν τρία Χ χρωμοσώματα και φυσιολογικό αριθμό αυτοσωμάτων. Τα άτομα αυτά είναι θηλυκά, έχουν κανονική πνευματική ανάπτυξη και είναι γόνιμα. Εξέταση των πυρήνων τους αποκαλύπτει την ύπαρξη 2 σωματίων Barr και συνεπώς μόνο ένα Χ είναι ενεργό. Επιπλέον, έχουν βρεθεί άτομα με 4 ή και 5 Χ χρωμοσώματα. Σε γενικές γραμμές δεν είναι στείρα και παρουσιάζουν πνευματική καθυστέρηση. Όμοια, έχουν γεννηθεί και αγόρια με πολλαπλά Χ χρωμοσώματα και ένα Υ. Οι περιπτώσεις τους μοιάζουν με αυτή του συνδρόμου Kleinefelter αλλά εμφανίζουν μεγαλύτερη πνευματική καθυστέρηση και λιγότερη ανάπτυξη των χαρακτηριστικών του φύλου. Στην περίπτωση αμφότερων θηλυκών και αρσενικών με πολλαπλά Χ χρωμοσώματα, όλα τα Χ εκτός από ένα αδρανοποιούνται. Και πάλι, αν η αδρανοποίηση ήταν πλήρης θα αναμενόταν τα άτομα αυτά να είναι φυσιολογικά.

Ενδείξεις για μια μερική τουλάχιστον διαφυγή από την αδρανοποίηση μιας περιοχής του Χ προέρχονται από μια μελέτη σχετικά με τη δραστικότητα ενός ενζύμου, της σουλφατάσης των στεροειδών (STS), του οποίου το γονίδιο εδράζεται στο Χ. Το ένζυμο αυτό καταλύει την υδρόλυση κάποιων 3-β-υδροξυστεροειδών θειικών αλάτων και η απουσία του –κυρίως στα αρσενικά – σχετίζεται με την ασθένεια ιχθύωση. Όταν η ενεργότητα του ενζύμου συγκρίθηκε σε θηλυκά και αρσενικά άτομα δε βρέθηκε να έχουν ισότιμη ενεργότητα, όπως προβλέπεται με βάση το πρότυπο της αδρανοποίησης. Αντίθετα, στα θηλυκά η ποσότητα του ενζύμου ήταν υψηλότερη, λιγότερη όμως από το διπλάσιο της ποσότητας που βρέθηκε στα αρσενικά.

Πρόσφατες έρευνες αναφέρονται σε 34 γονίδια του Χ χρωμοσώματος (Πίνακας 1, Εικόνα 10), τα οποία διαφεύγουν της αδρανοποίησης. Πρόκειται για γονίδια που χαρτογραφούνται στις ψευδοαυτοσωμικές περιοχές PAR1 και PAR2 οι οποίες συμπεριφέρονται ως αυτοσωμικές. Αυτό συμβαίνει επειδή υπάρχουν ομόλογες αλληλουχίες στο Υ με τις οποίες γίνεται η σύζευξη κατά τη μείωση. Επίσης, πρόκειται για γονίδια που έχουν ομόλογα στο Υ χρωμόσωμα. Αναφέρονται επίσης και γονίδια τα οποία ενώ δεν έχουν ομόλογα γονίδια στο Υ δεν αδρανοποιούνται αλλά και γονίδια τα οποία έχουν ομόλογα στο Υ αλλά είναι αδρανή ψευδογονίδια (π.χ. γονίδια KAL1, STS). Προφανώς, η διαφορά δόσης μεταξύ των δυο φύλων για τα γονίδια αυτά είναι ανεκτή και δεν προκαλεί πρόβλημα.

Τα γονίδια, που διαφεύγουν, αντανακλούν διαφορετικές επιγενετικές αποκρίσεις στην αδρανοποίηση του Χ και έχουν κλινική σημασία ως υποψήφια για φαινότυπους σχετικούς με ανευπλοειδία του Χ. Πολλές τεχνικές έχουν χρησιμοποιηθεί προκειμένου να καθοριστεί αν κάποιο γονίδια του Χ αδρανοποιείται ή όχι. Αυτές περιλαμβάνουν ανάλυση πρωτεϊνικών πολυμορφισμών για να διακρίνουν την έκφραση του αδρανούς Χ από αυτήν του δραστικού, ανακάλυψη μωσαϊκής έκφρασης μιας πρωτεΐνης σε ιστούς ετερόζυγων ατόμων για ασθένειες σχετικές με το Χ χρωμόσωμα ή σύγκριση των επιπέδων μιας πρωτεΐνης ή των επιπέδων των μεταγράφων της μεταξύ διαφορετικών ατόμων με διαφορετικό αριθμό Χ χρωμοσωμάτων.

Παρά το γεγονός ότι αυτές οι προσεγγίσεις είναι κατάλληλες για τη μελέτη ανεξάρτητων γονιδίων, ο καθορισμός ενός κατανοητού προφίλ ολόκληρου του Χ χρωμοσώματος απαιτεί ανάλυση ενός μεγάλου αριθμού γονιδίων. Η Laura Carrel και η επιστημονική της ομάδα ανέλυσαν την έκφραση γονιδίων του ανθρώπινου Χ χρωμοσώματος (δραστικού και αδρανούς) σε υβριδικά κύτταρα από ανθρώπους σε τρωκτικά, ως άμεσο μέτρο της κατάστασης ενός γονιδίου. Αυτή η μέθοδος δεν απαιτεί διάκριση των μεταγράφων στο Χ αδρανές και το δραστικό Χ και είναι εφαρμόσιμη σε όλα τα γονίδια που εκφράζονται από αυτά τα κύτταρα. Με αυτήν τη προσέγγιση, κάθε γονίδιο αναλύεται με RT-PCR (reverse transcription-PCR) για να καθοριστεί αν η έκφραση ανιχνεύεται μόνο στα υβριδικά κύτταρα που διατηρούν το Χα, στην περίπτωση που ένα γονίδιο αδρανοποιείται ή και στα δυο υβρίδια (Χα και Χ δραστικά), δείχνοντας ένα γονίδιο που διαφεύγει της αδρανοποίησης.

Σε αυτή τη μελέτη, έχει καθοριστεί η κατάσταση αδρανοποίησης 224 γονιδίων του Χ και εκφραζόμενων άκρων αλληλουχιών (ESTS) με RT-PCR ενός συνόλου πολλαπλών υβριδίων Χ δραστικού. Μαζί με δημοσιευμένες πληροφορίες για 23 επιπλέον γονίδια , αυτό το αρχικό προφίλ της αδρανοποίησης υπολογίζεται ότι αντιπροσωπεύει περίπου το 10% όλων των μεταγράφων του Χ. Από τα μετάγραφα που αναλύθηκαν σε αυτήν την μελέτη, 34 εκφράζονταν σε 9 υβρίδια Χ δραστικού και συνεπώς διαφεύγουν της αδρανοποίησης. Τα γονίδια αυτά είναι τυχαία διανεμημένα με την πλειονότητα αυτών να βρίσκονται στο μικρό βραχίονα του Χ. Η κατανομή αυτή δηλώνει πως οι δυο βραχίονες του Χ διαφέρουν όχι μόνο στην εξελικτική τους πορεία αλλά και υποδηλώνει ότι γενετική ανισορροπία του μικρού βραχίονα μπορεί να είναι πιο σοβαρή από μια ανισορροπία του μεγάλου βραχίονα.

Από τα 224 γονίδια του Χ που ελέγχθηκαν συνολικά, το 65% περίπου αντιπροσωπεύει γνωστά γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες ή μετάγραφα με ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωση (ORF). Το άλλο 35% είναι ESTs. Με βάση τη θέση τους στο Χ, οι ερευνητές υπέθεσαν πως λιγότερο από 5% αυτών μπορεί να αντιπροσωπεύει μη ανεξάρτητα μετάγραφα. Η πυκνότητα των γονιδίων και ESTs που αναλύθηκαν σε κάθε διάστημα στο Χ αντανακλά την κατανομή των γονιδίων σε τρέχοντες χάρτες μεταγραφών του Χ και τονίζει περιοχές ιδιαίτερα πλούσιες σε γονίδια όπως η Χp11 και η Xq28 και τη φτωχή σε γονίδια περιοχή Xq21.

Για να καθοριστεί η κατάσταση τους, τα γονίδια αναλύθηκαν σε 5 με 9 υβριδικά κύτταρα ανθρώπου/τρωκτικών, που καθένα περιείχε ένα διαφορετικό κυτταρογενετικά φυσιολογικό Χ δραστικό. Περίπου το 80% των γονιδίων ή των ETSs που ελέγχθηκαν έδωσαν απολύτως σύμφωνα αποτελέσματα σε όλα τα υβρίδια, δηλαδή είτε εκφράζονταν σε όλα τα υβρίδια Χ δραστικού (28 μετάγραφα), είτε «σιωπούσαν» σε όλα τα υβρίδια (147 μετάγραφα), που ελέγχθηκαν. 36 επιπλέον μετάγραφα έδωσαν σύμφωνα μοντέλα έκφρασης σε όλα εκτός από 1ή 2 υβρίδια. Αυτές οι κατηγορίες περιλαμβάνουν γονίδια που εκφράζονταν, για παράδειγμα σε 8 από τα 9 υβρίδια ή σε 1 από τα 9. Επειδή, η κατανομή αυτών των γονιδίων δεν ήταν τυχαία θεώρησαν αυτό το δεδομένο ως ενδεικτικό ενός μοντέλου αδρανοποίησης για αυτά τα γονίδια. Έτσι, από τα 224 γονίδια που ελέγχθηκαν, 177 εμφανίζονται ως αντικείμενο αδρανοποίησης ενώ 34 διαφεύγουν της αδρανοποίησης. Η κατάσταση 13 γονιδίων παρέμεινε αδιευκρίνιστη, γιατί εκφράζονταν στα μισά περίπου υβρίδια.

Τελικά, τα γονίδια που διαφεύγουν της αδρανοποίησης είναι πολύ περισσότερα στο μικρό βραχίονα του Χ από αυτά στο μεγάλο. Το 30% των γονιδίων που εξετάστηκαν στο μικρό βραχίονα διαφεύγουν της αδρανοποίησης ενώ το αντίστοιχο ποσοστό στο μεγάλο βραχίονα είναι μικρότερο από 3%. Αυτή η μη τυχαία κατανομή αντανακλά ένα μεγάλο σύνολο γονιδίων μέσα στην ψευδοαυτοσωμική περιοχή και γειτονικά αυτής σε απόσταση 15 Mb, τα οποία είναι μερικώς τουλάχιστον εκφραζόμενα από το δραστικό Χ. Επειδή όλα αυτά τα γονίδια μπορεί να ήταν ψευδοαυτοσωμικά σε κάποιο σημείο της εξέλιξης, το μοντέλο έκφρασης τους μπορεί να είναι επιγενετικό υπόλειμμα της εξελικτικής τους προέλευσης. Ακόμα και αν εξαιρεθούν αυτά τα γονίδια, η αναλογία των γονιδίων στο Χ που εκφράζονται από το δραστικό Χ (~21%) είναι ακόμα σημαντικά υψηλότερη από αυτή στο μεγάλο βραχίονα (~3%). Άλλες εξελικτικές μελέτες, έχουν καταλήξει στο συμπέρασμα ότι μεγάλο τμήμα του μικρού βραχίονα ήταν αρχικά αυτοσωμικό και προστέθηκε καιρό μετά από τότε που τα μαρσιποφόρα και τα πλακουντοφόρα θηλαστικά απέκλιναν από κάποιο κοινό πρόγονο. Επειδή τα αυτοσωμικά γονίδια δεν υπόκεινται σε εξισορρόπηση δόσης, τα δεδομένα αυτά δηλώνουν ότι πολλά γονίδια του μικρού βραχίονα του Χ μπορεί να μην έχουν αποκτήσει την ικανότητα να αδρανοποιούνται και επιπλέον είναι ενδεικτικά ότι η γενωμική οργάνωση των αλληλουχιών στο μεγάλο βραχίονα διαφέρει σε χαρακτηριστικό αλλά ακόμα άγνωστο τρόπο από αυτήν στο μικρό βραχίονα ή τα αυτοσώματα.

Οι ερευνητές για να επιβεβαιώσουν τα ευρήματα τους, έλεγξαν αρκετά γονίδια με ένα συμπληρωματικό σύστημα αναλύοντας πολυμορφισμούς σε ένα μεγάλο σύνολο κυτταρικών σειρών ινοβλαστών ανθρώπου με μη τυχαία αδρανοποίηση του Χ. Μοναλληλική έκφραση σε αυτές τις σειρές δείχνει ότι ένα γονίδιο είναι αντικείμενο αδρανοποίησης ενώ διαλληλική έκφραση επιδεικνύει ότι ένα γονίδιο εκφράζεται και από τα δυο Χ.

Όσον αφορά στο μηχανισμό διαφυγής, τίποτα ακόμα δεν είναι σίγουρο. Μέχρι στιγμής, δυο θεωρίες έχουν προταθεί. Η μια υποστηρίζει ότι τα γονίδια αυτά δεν έχουν τις κατάλληλες αλληλουχίες – σινιάλα που επάγουν την αδρανοποίηση. Η δεύτερη υποστηρίζει ότι τα γονίδια αυτά δεν έχουν τις κατάλληλες αλληλουχίες για τη διατήρηση της αρχικής αδρανοποίησης και επανενεργοποιούνται κατά την εμβρυϊκή ζωή.

Τέλος, τα γονίδια αυτά έχουν χαρακτηριστικά παρόμοια με αυτά των γονιδίων του δραστικού Χ σε ό,τι έχει σχέση με :

1. το χρόνο διπλασιασμού
2. την έλλειψη μεθυλίωσης των νησίδων CpG
3. την υπερακετυλίωση της ιστόνης Η4

ΒΙΒΛΙΑ

1. Αγγελοπούλου Ρ., “Πειραματική Εμβρυολογία”, Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ.Πασχαλίδης
2. AlbertsB. et al, “Βασικές Αρχές Κυτταρικής Βιολογίας”, Ιατρικές εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης 2000
3. Alberts B. et al: “Molecular Biology of the cell”, Garland Publishing, Inc.1998
4. Browder L. et al: “Developmental Biology”, Saunders College Publishing.
5. Cummings M., Hall P.: “Concepts of genetics”, 5th Edition
6. Gelehrter T. D. & Collins F. S., “Αρχές Ιατρικής Γενετικής”, Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ.Πασχαλίδης 1996
7. Latchmann D., “Gene Regulation”, Stanley Thornes (Publishers) Ltd. 3rd Edition.
8. Lewin B.,“Genes VI” O.U.P.2000
9. Lodish et al: “Molecular cell biology” 3rd edition, Scientific American Books.

ΑΡΘΡΑ

1. Lyon M.: “Some milestones in the history of X-chromosome in activation”, Annu. Rev. Gener. 26: 17-28, 1992.
2. Carrel L., Cottle A., Goglin K., Willard H.F.: “A first generation X-inactivation, profile of the human X chromosome” PNAS Vol. 96 ,Issue 25, 14440-14444, 1999.
3. Carrel L., Brown C., Willard H. Hum A.: “ Expression of genes from the human active and inactive X chromosome” Genet. 60: 1333-1343, 1997.
4. Avner P. Clerc P. Heard E.: “X-chromosome inactivation in mammals” Annu. Rev. Genet. 31: 571-610, 1997.

Εργασία που παρουσιάστηκε από τη φοιτήτρια Ιατρικής Βλαχοδημήτρη Αγγελική
στα πλαίσια του κατ'επιλογήν μαθήματος της Πειραματικής Εμβρυολογίας
Υπεύθυνη μαθήματος : Ρωξάνη Αγγελοπούλου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια
Εργαστήριο Ιστολογίας και Εμβρυολογίας
Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών
Για περισσότερες πληροφορίες μπορείτε να ανατρέξετε στον ιστότοπο του μαθήματος της Πειραματικής Εμβρυολογίας: http://www.med.uoa.gr/expembr/
Τελευταία αναθεώρηση : 1/5/2006