1.2 ΕΞΕΡΕΥΝΩΝΤΑΣ ΤΟ ΚΕΝΤΡΟ ΤΗΣ ΑΔΡΑΝΟΠΟΙΗΣΗΣ

Για την πλήρη κατανόηση του φαινομένου της αδρανοποίησης του χρωμοσώματος Χ απαιτείται η επίλυση ορισμένων βιολογικών γρίφων:

Πως αδρανοποιείται μόνο το ένα από τα δύο Χ χρωμοσώματα στον ίδιο πυρήνα; Πως γίνεται η καταμέτρηση των Χ χρωμοσωμάτων για να διατηρηθεί τελικά μόνο ένα από αυτά ενεργό; Πως επιλέγεται το Χ χρωμόσωμα που πρόκειται να αδρανοποιηθεί; Πως καθιερώνεται στο χρωμόσωμα αυτή η αδρανοποιημένη κατάσταση σε τόσο σύντομο χρονικό διάστημα και κατά τρόπο σταθερό κατά τα αρχικά στάδια της εμβρυογένεσης;

Το κλειδί για την απάντηση στα παραπάνω ερωτήματα βρίσκεται στο ίδιο το Χ χρωμόσωμα σε ένα μοναδικό γενετικό τόπο...

ΤΟ ΚΕΝΤΡΟ ΤΗΣ ΑΔΡΑΝΟΠΟΙΗΣΗΣ

Η πρώτη γενετική μαρτυρία που προτείνει την ύπαρξη ενός κέντρου αδρανοποίησης προέκυψε από τη μελέτη X-αυτοσωμικών μεταθέσεων σε ανθρώπους και ποντίκια . Η Russell L.B. (1963) παρατήρησε πρώτη ότι σε τέτοιες μεταθέσεις μόνο ένα από τα προκύπτοντα χρωμοσώματα υπόκειντο σε αδρανοποίηση. Έτσι κατέληξε στο συμπέρασμα ότι υπάρχει μια περιοχή στο χρωμόσωμα Χ που είναι απαραίτητη για την επίτευξη της αδρανοποίησης. Μετέπειτα πειράματα που έγιναν χρησιμοποιώντας τη μετάθεση του Cattanach (μεταξύ των χρωμοσωμάτων 7 και Χ του ποντικού), έδειξαν ότι η αδρανοποίηση υπερπηδούσε ορισμένες περιοχές, δημιουργώντας την πεποίθηση στους επιστήμονες ότι υπάρχουν περισσότερα από ένα κέντρα αδρανοποίησης. Αργότερα όμως διαπιστώθηκε ότι και αυτές οι περιοχές αρχικά αδρανοποιούνται, αλλά μετά επανενεργοποιούνται, γεγονός που ενίσχυσε την υπόθεση που υποστήριζε την ύπαρξη ενός μόνο κέντρου αδρανοποίησης.

Το 1974 οι Therman et al. διατύπωσαν την άποψη ότι η συμπύκνωση του αδρανούς Χ χρωμοσώματος συμβαίνει γύρω από ένα κέντρο (locus) στο μεγάλο βραχίονα του χρωμοσώματος κοντά στο κεντρομερίδιο. Το συμπέρασμα αυτό προέκυψε από παρατηρήσεις που έκαναν σε ανώμαλες μορφές Χ χρωμοσωμάτων. Πιο συγκεκριμένα, παρατήρησαν ότι από τα Χ χρωμοσώματα με το υποτιθέμενο κέντρο σε διπλασιασμένη μορφή προέκυπταν διμερή σωμάτια Barr, ενώ δεν εντόπισαν κανένα ισοχρωμόσωμα του μικρού βραχίονα του Χ χρωμοσώματος (Xpi). Πρότειναν ότι το Xpi ήταν θνησιγόνο, γιατί το κύτταρο που το περιείχε δεν διέθετε μέθοδο αντιστάθμισης της δόσης. Αργότερα, το 1981 οι Mattei et al. από μελέτες σε πέντε περιπτώσεις δομικών ανωμαλιών που αφορούσαν τα χρωμοσώματα Χ, κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι το χρωμόσωμα Χ έχει ένα και μόνο κέντρο αδρανοποίησης, το οποίο εδράζεται στην περιοχή μεταξύ Xq11.2 και Xq21.1.

για την κλωνοποίηση και ανάλυση της περιοχής αυτής. Ένας από τους δείκτες που εντοπίστηκαν στην περιοχή ήταν και το γονίδιο XIST, το οποίο εκφράζεται αποκλειστικά από το αδρανές Χ χρωμόσωμα (XIST = Χ-inactive specific transcript). Λίγο αργότερα εντοπίστηκε και το κέντρο αδρανοποίησης του ποντικού, το οποίο ονομάστηκε Xic (X-inactivation center), στο περιφερικό τμήμα της ζώνης D.

Το κέντρο αδρανοποίησης ορίζεται ως ο τόπος από τον οποίο το σήμα της αδρανοποίησης εξαπλώνεται in cis προς τις δύο κατευθύνσεις κατά μήκος του χρωμοσώματος Χ. Καταλαμβάνει μια περιοχή 450 kb που αντιστοιχεί στη θέση που διπλώνει το αδρανοποιημένο Χ χρωμόσωμα, όπως φαίνεται σε κυτταρολογικά παρασκευάσματα. Η σειρά των γενετικών τόπων γύρω από το XIC είναι: κεντρομερίδιο – AR – CCG1 – PHKA – XIC – PGK1 – τελομερίδιο, όπως φαίνεται και στον παρακάτω χάρτη:

Το φαινόμενο της αδρανοποίησης του χρωμοσώματος Χ ξεκινά με την διαδικασία της καταμέτρησης των Χ χρωμοσωμάτων που υπάρχουν στο κύτταρο. Αυτή είναι απαραίτητη για να αδρανοποιηθούν όλα τα Χ εκτός από ένα, στο διπλοειδικό κύτταρο (Ο αριθμός των δραστικών Χ είναι ανάλογος του αριθμού των αυτοσωμάτων, έτσι σε ένα διπλοειδικό κύτταρο φυσιολογικά μόνο το ένα Χ είναι δραστικό). Στη συνέχεια επιλέγεται ποιο από τα δύο Χ χρωμόσωμα θα αδρανοποιηθεί και κατόπιν παράγεται ένα σήμα έναρξης της αδρανοποίησης που εξαπλώνεται in cis κατά μήκος του αδρανοποιούμενου Χ χρωμοσώματος. Το XIC/Xic περιέχει στοιχεία που ελέγχουν, όπως θα δούμε παρακάτω και τις τρεις προαναφερθείσες διαδικασίες.

Στο XIC/Xic εκτός από το γονίδιο XIST/Xist (X-inactive specific transcript) περιέχεται το antisense γονίδιο του XIST/Xist, TSIX/Tsix καθώς και τα BRX/Brx (Brain X-linked) και CDX4/Cdx4 (Caudal type homeo box transcription factor 4), ενώ μόνο στο Xic εντοπίζονται επιπλέον το γονίδιο Tsx (Testis X-linked) και τα αλληλόμορφα Xce (X-controlling element). Από αυτά το XIST/Xist και το TSIX/Tsix είναι οι κύριοι πρωταγωνιστές στη διαδικασία της αδρανοποίησης, όπως θα δούμε παρακάτω. Αντίθετα τα BRX/Brx, CDX4/Cdx4 και Tsx δεν φαίνεται να έχουν σχετική δράση.

Όσο αφορά στο Xce, η ακριβής φύση καθώς και ο ρόλος του δεν είναι ακόμα γνωστοί. Αυτό που είναι βέβαιο είναι ότι επηρεάζουν την πιθανότητα επιλογής (50%-50%) ως δραστικού του ενός Χ σε ετερόζυγα ποντίκια. Μέχρι σήμερα έχουν περιγραφεί τέσσερα αλληλόμορφα Xce: το Xceα, το Xceb , το Xcec και το Xced . Στους ετεροζυγώτες Xceα/ Xceb μεγαλύτερη πιθανότητα να αδρανοποιηθεί έχει το Xceα και στους ετεροζυγωτές Xceb / Xcec μεγαλύτερη πιθανότητα να αδρανοποιηθεί έχει το Xceb . Το Xced αλληλόμορφο πάντως φαίνεται να είναι το ισχυρότερο. Η ισχύς του αλληλόμορφου Xce είναι αντιστρόφως ανάλογη του βαθμού έκφρασης του Xist από το αδρανές Χ, αφού τα ποντίκια που περιέχουν το αλληλόμορφο Xced παρουσιάζουν χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης του Xist, απ’ ότι αυτά που περιέχουν το αλληλόμορφο Xceb.

Τα στοιχεία που περιέχονται στο κέντρο αδρανοποίησης του ποντικού – Xic - παρουσιάζονται συνοπτικά στο παρακάτω σχήμα. Πρέπει να επισημάνουμε ότι παρόμοια είναι και η μορφή του αντίστοιχου κέντρου στον άνθρωπο – XIC – με δεδομένες τις διαφορές που αναφέρθηκαν προηγουμένως, καθώς και αυτές που έχουν προκύψει από την εξελικτική διαδικασία (βλ. παράγραφο “Το γονίδιο TSIX”).

ΤΟ ΓΟΝΙΔΙΟ XIST/Xist

Η μοριακή φύση του κέντρου της αδρανοποίησης παρέμενε μυστήριο μέχρι το 1991, όταν οι Brown et al., μελετώντας την περιοχή του XIC ανήγγειλαν την ανακάλυψη του γονιδίου XIST στον άνθρωπο. Εκείνη την εποχή ήταν γνωστό ότι ορισμένα γονίδια διαφεύγουν της αδρανοποίησης και εκφράζονται τόσο από το ενεργό, όσο και από το αδρανές Χ χρωμόσωμα, ωστόσο το XIST παρουσίασε ένα νέο πρότυπο έκφρασης που δεν είχε παρατηρηθεί ξανά. Το γονίδιο αυτό εκφράζεται αποκλειστικά από το αδρανές Χ χρωμόσωμα, όπως δηλώνει και το όνομά του (XIST= Χ-Inactive Specific Transcript). Αυτό προέκυψε από πειράματα υβριδισμού, όπου το XIST cDNA υβριδοποιούνταν με RNA που προερχόταν από θηλυκά κύτταρα ή υβρίδια σωματικών κυττάρων που περιείχαν ένα αδρανές Χ χρωμόσωμα, αλλά όχι με RNA από αρσενικά κύτταρα ή υβρίδια που περιείχαν μόνο ένα ενεργό Χ χρωμόσωμα. Ένα στοιχείο που σχετίζεται άμεσα με την αποκλειστική έκφραση του XIST από το αδρανές Χ χρωμόσωμα είναι η χρονική στιγμή της αντιγραφής του. Βρέθηκε με ανάλυση FISH ότι το XIST αλληλόμορφο στο αδρανές Χ χρωμόσωμα αντιγράφεται πριν το ομόλογό του στο ενεργό Χ σε αντίθεση με την πλειονότητα των γονιδίων στο αδρανές Χ.

Το γονίδιο XIST εντοπίζεται στην περιοχή Xq13.2, όπως αποδείχθηκε με in situ υβριδισμό. Το μέγεθός του υπολογίστηκε 16.5 kb και αποτελείται από 8 εξώνια, τα 2 εκ των οποίων είναι ασυνήθιστα μεγάλα (11 kb και 4.5 kb). Πρόσφατα ανακοινώθηκε από τους Hong et al. (2000) ότι στο XIST ανήκει και η αλληλουχία μήκους 2.8 kb που βρίσκεται καθοδικά του γονιδίου, οπότε το συνολικό του μήκος είναι 19.3 kb. Μάλιστα η νέα αυτή περιοχή περιέχει ένα ιντρόνιο και επτά αλληλουχίες-σήματα πολυαδενυλίωσης. Το γονίδιο XIST περιέχει πολλές επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες, οι περισσότερες από τις οποίες εντοπίζονται στο 5΄άκρο του και είναι εξελικτικά συντηρημένες.

Το ομόλογο του XIST γονίδιο στο ποντίκι απομονώθηκε και αναγνωρίστηκε από τους Borsani et al. (1991). Και αυτό εντοπίστηκε στο αντίστοιχο κέντρο αδρανοποίησης του ποντικού, δηλαδή στο Χic, στη ζώνη D (Brockdorff et al., 1991) και αποδείχθηκε ότι εκφράζεται αποκλειστικά από το αδρανές Χ χρωμόσωμα, όπως και το ανθρώπινο ομόλογό του, παίρνοντας έτσι την ονομασία Xist. Οι Brockdorff et al. (1992) ανέλυσαν ολόκληρο το γονίδιο Xist και βρήκαν ότι έχει μήκος 15 kb και αποτελείται από 6 εξώνια. Και αυτό περιέχει επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες και γενικά τα περισσότερα χαρακτηριστικά του είναι ίδια με αυτά του XIST.

Τα γονίδια XIST και Xist παρουσιάζουν πολύ μεγάλη ομολογία μεταξύ τους. Συνολικά οι αλληλουχίες των δύο cDNA είναι ταυτόσημες κατά περίπου 76%. Αυτή η ομοιότητα των αλληλουχιών διακόπτεται σε πολλά σημεία από αλληλουχίες που απαντώνται στο XIST, αλλά όχι και στο Xist, γεγονός που υποδηλώνει έλλειψη εξελικτικών ορίων μεταξύ πολλών περιοχών του XIST. Η μεγαλύτερη ομοιότητα μεταξύ του XIST και του Xist παρατηρείται μεταξύ πέντε επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών στα εξώνια 1 και 6. Δύο από τις πέντε αυτές επαναλήψεις είναι πολύ καλά συντηρημένες. Ωστόσο η πιο καλά συντηρημένη αλληλουχία βρίσκεται στο 5΄ άκρο του εξωνίου 1, με εννέα επαναλήψεις στον άνθρωπο και οκτώ στο ποντίκι και πιθανολογείται ότι λειτουργεί ως θέση πρόσδεσης πρωτεΐνης στο RNA ή ως αλληλουχία ελέγχου (μέσω διαφορετικής μεθυλίωσης) σχετιζόμενη με το Xce.

Από την πρώτη στιγμή της ανακάλυψής του μέσα στην περιοχή του XIC/Xic στην προσπάθεια να ερμηνευτεί το ιδιαίτερο πρότυπο έκφρασής του, οι επιστήμονες υπέθεταν ότι το γονίδιο XIST/Xist είτε εμπλέκεται στη διαδικασία της αδρανοποίησης, είτε επηρεάζεται από αυτή κατά μοναδικό τρόπο (Brown et al.,1991). Το 1993 οι Kay et al. έδειξαν ότι η έναρξη της έκφρασης του Xist κατά την ανάπτυξη προηγείται της αδρανοποίησης του χρωμοσώματος Χ και επομένως είναι περισσότερο πιθανό να αποτελεί αιτία της αδρανοποίησης παρά συνέπειά της. Τα αποτελέσματα αυτά σε συνδυασμό με άλλες μελέτες διαφόρων επιστημόνων οδηγούσαν στο συμπέρασμα ότι το XIST/Xist κατέχει κεντρικό ρυθμιστικό ρόλο “διακόπτη” στη διαδικασία της αδρανοποίησης. Η θεωρία αυτή επιβεβαιώθηκε με τα πειράματα των Penny et al. (1996) σε εμβρυϊκά στελεχιαία (ES) κύτταρα ποντικού. Τα αποτελέσματά τους απέδειξαν ότι το Xist είναι απαραίτητο για την επίτευξη της αδρανοποίησης. Το ίδιο ισχύει και για το XIST.

Στα θηλυκά (ΧΧ) ES κύτταρα, όταν αυτά διατηρούνται σε αδιαφοροποίητη κατάσταση, και τα δύο Χ χρωμοσώματα είναι ενεργά και το Xist εκφράζεται σε πολύ χαμηλά επίπεδα. Όταν όμως αφεθούν να διαφοροποιηθούν, αδρανοποιείται το ένα Χ χρωμόσωμα και η έκφραση του Xist αυξάνεται σημαντικά. Οι Penny et al. δημιούργησαν μια έλλειψη στο Xist αυτών των κυττάρων, ετερόζυγων ως προς το Xce, αφαιρώντας 36 bp από το μικρό υποκινητή και 7 kb από το πρώτο εξώνιο με τη χρήση ομόλογου ανασυνδυασμού και έδειξαν ότι αυτή η έλλειψη κατέστειλε την ενεργότητα του γονιδίου. Όταν τα ES κύτταρα που ήταν ετερόζυγα ως προς το Xist και άλλα Χ-συνδεδεμένα γονίδια αφέθηκαν να διαφοροποιηθούν, η αδρανοποίηση του Χ χρωμοσώματος συνέβη, όπως φάνηκε από ένα χρωμόσωμα που αντιγράφτηκε ετερόχρονα, αλλά αδρανοποιούνταν μόνο το φυσιολογικό Χ χρωμόσωμα που δεν έφερε την έλλειψη. Έτσι κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι ο μηχανισμός καταμέτρησης αναγνώριζε το Xic με το null Xist αλληλόμορφο, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο μηχανισμός της καταμέτρησης δεν εξαρτάται από τις αφαιρεθείσες αλληλουχίες. Επίσης συμπέραναν ότι το φυσιολογικό ή το knockout X μπορούσαν να επιλεγούν για να παραμείνουν ενεργά με μια πιθανότητα που καθοριζόταν από τα διαφορετικά Xce αλληλόμορφα που έφεραν και ότι αν επιλεγόταν να παραμείνει ενεργό το knockout X, το άλλο Χ χρωμόσωμα υπόκειντο κανονικά σε αδρανοποίηση, αλλά αν επιλεγόταν το φυσιολογικό, τότε το knockout X δεν μπορούσε να αδρανοποιηθεί και το κύτταρο παρέμενε με δύο Χ χρωμοσώματα ενεργά.

Οι επιστήμονες μελέτησαν επίσης τις επιπτώσεις της έλλειψης αυτής στο Xist in vivo σε χιμαιρικά έμβρυα που δημιουργήθηκαν από τη σύντηξη των ES κυττάρων που έφεραν την έλλειψη με φυσιολογικά έμβρυα στο στάδιο των 8 κυττάρων. Και πάλι ο μηχανισμός της καταμέτρησης λειτούργησε κανονικά, η αδρανοποίηση συνέβη και για μια ακόμη φορά αδρανοποιήθηκαν μόνο τα Χ χρωμοσώματα που έφεραν το φυσιολογικό Xist αλληλόμορφο. Σε αντίθεση με τα ES κύτταρα, δεν παρατηρήθηκαν κύτταρα με δύο ενεργά Χ χρωμοσώματα, παρατήρηση που συμφωνεί με παλαιότερη μελέτη που είχε δείξει ότι κύτταρα με πλεονάζουσα ενεργότητα των Χ χρωμοσωμάτων τους περιορίζονται πολύ γρήγορα από την κυτταρική επιλογή. Επομένως τα αποτελέσματα των πειραμάτων των Penny et al. δίνουν τη χειροπιαστή απόδειξη ότι η έκφραση του γονιδίου Xist απαιτείται in cis για να συμβεί η αδρανοποίηση και να εξαπλωθεί κατά μήκος του Χ χρωμοσώματος, στο οποίο εμφανίζεται και διαχωρίζονται οι λειτουργίες της καταμέτρησης των Χ χρωμοσωμάτων και της εξάπλωσης της αδρανοποίησης ως ελεγχόμενες από διαφορετικές περιοχές του κέντρου XIC/Xic (τον ίδιο χρόνο οι Migeon et al. απέδειξαν ότι ο μηχανισμός της καταμέτρησης στον άνθρωπο ελέγχεται από αλληλουχίες του XIC διαφορετικές από αυτές που ελέγχουν την αδρανοποίηση).

Με σκοπό την ανακάλυψη περιοχών στο γονίδιο Xist που είναι λειτουργικά σημαντικές για τα διάφορα στάδια της αδρανοποίησης του χρωμοσώματος Χ, οι Clerc και Avner (1998) δημιούργησαν μια έλλειψη της περιοχής 3΄του εξωνίου 6 σε ES κύτταρα ποντικού. Στα αδιαφοροποίητα ΧΧ ES κύτταρα η έκφραση του Xist από το Χ χρωμόσωμα με την έλλειψη μειώθηκε αισθητά. Στα διαφοροποιημένα ΧΧ ES κύτταρα που περιείχαν ένα Χ χρωμόσωμα με την έλλειψη η αδρανοποίηση συνέβαινε, αλλά ποτέ δεν αδρανοποιούνταν το φυσιολογικό Χ χρωμόσωμα. Στα διαφοροποιημένα Χ0 κύτταρα το μεταλλαγμένο Xic μπορούσε να ξεκινήσει την αδρανοποίηση ακόμη και απουσία ενός δεύτερου, φυσιολογικού Xic. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ένα σημαντικό ρόλο της περιοχής 3΄του εξωνίου 6 του Xist στο μηχανισμό της καταμέτρησης και προτείνουν την ύπαρξη ενός μηχανισμού καταστολής που ρυθμίζει τη διαδικασία της καταμέτρησης των Χ χρωμοσωμάτων και προφυλάσσει ένα Χ χρωμόσωμα από την αδρανοποίηση στα διπλοειδή κύτταρα.

ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ XIST/Xist ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ

Σε θηλυκά σωματικά κύτταρα το γονίδιο XIST εκφράζεται μόνο από το αδρανές Χ χρωμόσωμα. Στα κύτταρα της γαμετικής σειράς όμως, εκφράζεται κατά τη διάρκεια τόσο της σπερματογένεσης όσο και της ωογένεσης. Στα αρσενικά η αδρανοποίηση του Χ χρωμοσώματος συμβαίνει μόνο στους όρχεις κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης, στην οποία το μοναδικό Χ χρωμόσωμα αδρανοποιείται. Η ποσότητα του XIST RNA στην σπερματογένεση φαίνεται ότι είναι μικρότερη σε σύγκριση με αυτή που απαντάται στα θηλυκά σωματικά κύτταρα. Το XIST RNA έχει βρεθεί και σε όρχεις νεογέννητων και ενηλίκων ποντικών καθώς και σε ανθρώπινους όρχεις με φυσιολογική σπερματογένεση.

Ο μηχανισμός καταμέτρησης, στον οποίο ενέχεται το γονίδιο XIST, φαίνεται ότι λειτουργεί στα αρσενικά, όπως προκύπτει από μελέτες σε καρκίνους των όρχεων. Καρκινώματα που προέρχονταν από γεννητικά κύτταρα όρχεων βρέθηκε ότι είχαν αποκτήσει Χ χρωμοσώματα και αυτά τα χρωμοσώματα υπόκειντο στη δράση του XIST, δηλαδή αδρανοποιούνταν.

Σε ωοκύτταρα ποντικού η έκφραση του Xist ανιχνεύεται μόνο στις 12.5 - 13.5 μέρες μετά τη σύλληψη (dpc), αλλά ποτέ στο διάστημα μεταξύ 13.5 και 18.5 dpc, οπότε και το ωοκύτταρο εισέρχεται στη μείωση και το Χ χρωμόσωμα επανενεργοποιείται Γενικά τα χρωμοσώματα Χ παραμένουν ενεργά κατά την ωορρηξία και τη γονιμοποίηση μέχρι να συμβεί η γονιμοποίηση κατά το στάδιο της προεμφύτευσης. Επομένως η έκφραση του Xist στη γαμετογένεση φαίνεται να είναι παροδική, αλλά έχει τα ίδια χαρακτηριστικά στα αρσενικά και τα θηλυκά.

Κατά την προεμφυτευτική περίοδο ανάπτυξης του ποντικού εκφράζεται αποκλειστικά το γονίδιο Xist του πατρικής προέλευσης αλληλομόρφου και αυτό φαίνεται ότι παίζει ρόλο στην αδρανοποίηση του πατρικού Χ χρωμοσώματος στους εξωεμβρυϊκούς ιστούς του αναπτυσσόμενου εμβρύου. Επιλεκτική αδρανοποίηση του πατρικού Χ χρωμοσώματος συμβαίνει και σε κύτταρα ανθρώπινης τροφοβλάστης στο πρώτο τρίμηνο (Goto et al.,1997) κατάσταση που παραμένει μέχρι τη γέννηση, όπου η επιλεκτική αδρανοποίηση του πατρικού Χ χρωμοσώματος είναι ορατή σε πλακούντες. Οι Daniels et al. (1997) εξέτασαν την πιθανή παρόμοια συσχέτιση μεταξύ του προτύπου της έκφρασης του XIST σε ανθρώπινα προεμφυτευτικά έμβρυα και της αδρανοποίησης του πατρικού Χ χρωμοσώματος. Τα πειράματά τους αποκάλυψαν ένα πρότυπο έκφρασης για το XIST διαφορετικό από αυτό του ποντικού. Μετάγραφα του γονιδίου XIST εντοπίστηκαν ακόμη και στο ζυγώτη (1 κύτταρο) και σε αυξανόμενο βαθμό μέχρι το στάδιο των 8 κυττάρων της προεμφυτευτικής περιόδου. Επιπλέον μετάγραφα του XIST ανιχνεύθηκαν τόσο σε θηλυκά όσο και σε αρσενικά (άρα από το μητρικής προέλευσης αλληλόμορφο) προεμφυτευτικά έμβρυα. Αυτό το πρότυπο έκφρασης δεν συνάδει με την άσκηση κάποιου είδους επίδρασης της πρώιμης έκφρασης του XIST στην επιλογή για την αδρανοποίηση του πατρικού Χ χρωμοσώματος στους εξωεμβρυϊκούς ιστούς του αναπτυσσόμενου ανθρώπινου εμβρύου.

Ελεύθερο Ανάγνωσμα - “Μη τυχαία αδρανοποίηση στον άνθρωπο;”

Παρ’ότι η αδρανοποίηση είναι τυχαία στα σωματικά κύτταρα του ανθρώπου και τα δύο Χ χρωμοσώματα στα θηλυκά κύτταρα έχουν την ίδια πιθανότητα (50:50) να αδρανοποιηθούν στο ίδιο κύτταρο, στον ανθρώπινο πληθυσμό έχουν παρατηρηθεί ορισμένες φυσιολογικές γυναίκες με αποκλίσεις από τον παραπάνω κανόνα. Οικογένειες, στις οποίες πολλά θηλυκά άτομα παρουσιάζουν πρότυπα επιλεκτικής αδρανοποίησης, που κατά τα άλλα είναι πολύ σπάνια στον ανθρώπινο πληθυσμό, θεωρείται ότι αντανακλούν πιθανές γενετικές επιδράσεις στη διαδικασία της αδρανοποίησης του χρωμοσώματος Χ. Το 1997 οι Plenge et al. ανακάλυψαν μια μετάλλαξη στο μικρό υποκινητή του γονιδίου XIST σε θηλυκά άτομα μιας οικογένειας που είχε αναφερθεί από τους Rupert et al. (1995) ότι παρουσίαζε μη τυχαία αδρανοποίηση. Η μετάλλαξη ήταν μια μεταστροφή C σε G στη θέση –43 του μικρού υποκινητή στο αδρανές Χ χρωμόσωμα.

Η μετάλλαξη αυτή δημιούργησε μια καινούργια θέση για το περιοριστικό ένζυμο HhaІ, η οποία χρησιμοποιήθηκε για να διαπιστωθεί η ύπαρξη της μετάλλαξης σε μια σειρά από μη συγγενικές οικογένειες, δηλαδή σε 1166 ανεξάρτητα χρωμοσώματα. Η μετάλλαξη εντοπίστηκε μόνο σε ένα επιπλέον χρωμόσωμα σε αυτό τον έλεγχο, αποκλείοντας έτσι την πιθανότητα να αντιπροσωπεύει ένα κοινό πολυμορφισμό. Η ετερόζυγη ως προς τη μετάλλαξη γυναίκα που εντοπίστηκε από την έρευνα ήταν μέλος μιας μεγάλης οικογένειας με σύνδρομο νοητικής καθυστέρησης Snyder-Robinson, το οποίο εδράζεται στην περιοχή Xp22.12-p21.3. Η ανάλυση απλότυπου υπέδειξε ότι οι δύο οικογένειες ήταν ανεξάρτητες μεταξύ τους και δεν είχαν καμιά συγγένεια. Περαιτέρω ανάλυση στη δεύτερη οικογένεια αποκάλυψε ότι 6 ακόμα γυναίκες και 4 άνδρες είχαν κληρονομήσει τη συγκεκριμένη μετάλλαξη.

ΤΟ XIST/Xist RNA

Όπως αναφέρθηκε παραπάνω το γονίδιο XIST/Xist μεταγράφεται και παράγει το XIST/Xist RNA. Αυτό ελλείψει συντηρημένου ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης (ORF) δεν μεταφράζεται, αλλά, όπως θα δούμε παρακάτω, παίζει καταλυτικό ρόλο στη διαδικασία της αδρανοποίησης του χρωμοσώματος Χ. Το XIST/Xist RNA είναι ένα μεγάλο και πολυαδενυλιωμένο μετάγραφο, το οποίο υπόκειται σε εναλλακτική συναρμολόγηση, όπως προκύπτει από εφαρμογή RT-PCR (Reverse Transcript Polymerase Chain Reaction). Ένα από τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά του είναι η εντόπισή του. Μετά από εξέταση πυρηνικών και κυτταροπλασματικών κλασμάτων για τον εντοπισμό του XIST RNA με εφαρμογή της RT-PCR αυτό εντοπίστηκε στο πυρηνικό κλάσμα. Για τον ακριβέστερο εντοπισμό του χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος FISH (Fluorescent in situ Hybridization), η οποία έδειξε ότι το XIST RNA βρίσκεται στο σωμάτιο Barr, και είναι στενά συνδεδεμένο με αυτό (Brown et al., 1992). Στα ανευπλοειδικά κύτταρα 47,ΧΧΧ και 49,ΧΧΧΧΧ εντοπίστηκαν δύο και τέσσερα σήματα υβριδισμού με το XIST RNA αντίστοιχα, αριθμός που είναι ίσος με τον αριθμό των ενεργών Χ χρωμοσωμάτων σε κάθε κύτταρο. Και στο ποντίκι το Xist RNA βρέθηκε ότι δεν σχετίζεται με τη μεταφραστική διαδικασία του κυττάρου, αλλά παραμένει αποκλειστικά στον πυρήνα, καλύπτοντας το αδρανές Χ χρωμόσωμα.

Περαιτέρω FISH αναλύσεις έδειξαν ότι υπάρχουν δύο τύποι XIST/Xist RNA: ένα μικρό που σχετίζεται με την μεταγραφική διαδικασία και ένα μεγαλύτερο και πλήρως συναρμολογημένο που σχετίζεται με το αδρανές Χ χρωμόσωμα. Επίσης η πέψη του χρωμοσωμικού DNA αποκάλυψε ότι το XIST RNA παραμένει στον πυρήνα, πιθανότατα συνδεδεμένο με αδιάλυτα πρωτεϊνικά στοιχεία του πυρηνικού στρώματος. Από τις παραπάνω μελέτες φαίνεται ότι το XIST RNA είναι ένα δομικό στοιχείο του αδρανούς Χ χρωμοσώματος.

Η λειτουργία του Xist RNA εξακριβώθηκε από τα πειράματα των Marahrens et al. (1997). Στα πειράματα αυτά οι ερευνητές αντικατέστησαν 15 kb του γονιδίου Xist με ένα γονίδιο αντίστασης στη νεομυκίνη (neo), αφαιρώντας τα γονίδια 1-5 και αφήνοντας μόνο τον υποκινητή και μέρος της 5΄Α περιοχής του εξωνίου 1 σε μια κυτταρική σειρά αρσενικών ES κυττάρων. Η ανάλυση FISH έδειξε ότι το σύμπλοκο Χist-neo εκφραζόταν. Χρησιμοποιώντας αυτά τα κύτταρα δημιουργήθηκαν αρσενικά και θηλυκά χιμαιρικά ποντίκια .Παρατήρησαν ότι τα αρσενικά που είχαν κληρονομήσει το μεταλλαγμένο Χist αλληλόμορφο αναπτύσσονταν φυσιολογικά και ήταν υγιή. Η σπερματογένεση δεν είχε επηρεαστεί, δηλαδή τα ποντίκια αυτά ήταν γόνιμα και μπορούσαν να παράγουν απογόνους, αν και όλοι ήταν αρσενικοί. Τα θηλυκά που είχαν κληρονομήσει το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο από τη μητέρα τους επίσης ήταν υγιή και το φυσιολογικό πατρικό Χ αδρανοποιούνταν σε κάθε κύτταρο τους. Τα θηλυκά όμως που είχαν κληρονομήσει το μεταλλαγμένο Xist αλληλόμορφο από τον πατέρα τους παρουσίαζαν σοβαρή καθυστέρηση της ανάπτυξης και πέθαιναν κατά τα αρχικά στάδια της εμβρυογένεσης. Σε κάθε κύτταρο των εμβρύων αυτών το φυσιολογικό μητρικό Χ χρωμόσωμα ήταν αδρανές, ενώ και τα δύο Χ χρωμοσώματα εκφράζονταν στη μεταλλαγμένη τροφοβλάστη, όπου η αδρανοποίηση είναι αποτυπωμένη (μη τυχαία/επιλεκτική). Παρ’όλα αυτά ένα Χ0 ποντίκι που έφερε τη μετάλλαξη σε πατρικό Χ χρωμόσωμα ήταν υγιές και φαινόταν φυσιολογικό. Οι Marahrens et al. κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι η θνησιμότητα στους θηλυκούς απογόνους με το πατρικής προέλευσης μεταλλαγμένο Xist αλληλόμορφο οφειλόταν στην αδυναμία των εξωεμβρυϊκών ιστών με δύο ενεργά Χ χρωμοσώματα να διατηρήσουν το έμβρυο. Έλλειψη της αδρανοποίησης του αποτυπωμένου Χ χρωμοσώματος στην τροφοβλάστη προφανώς οδηγούσε σε γενετικά ασταθή κύτταρα, λανθασμένη γονιδιακή έκφραση και λάθη στη λειτουργία της. Η ερμηνεία αυτή ενισχύεται και από το γεγονός ότι τα Χ0 ποντίκια που κληρονομούν το μεταλλαγμένο Xist αλληλόμορφο επιζούν έχοντας μόνο ένα χρωμόσωμα ενεργό στο τροφοεξώδερμα. Τα αποτελέσματα αυτά έδειξαν ότι το Xist RNA απαιτείται για την επίτευξη της αδρανοποίησης και κατά συνέπεια την αντιστάθμιση δόσης στα θηλυκά κύτταρα.

Το XIST /Xist RNA είναι λοιπόν απαραίτητο για την αδρανοποίηση. Πώς όμως δρα; Πριν από την έναρξη της τυχαίας αδρανοποίησης το γονίδιο XIST εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα και από τα δύο Χ χρωμοσώματα στα θηλυκά εμβρυϊκά στελεχιαία (ES) κύτταρα (παρόμοια έκφραση του XIST παρατηρείται και από το μοναδικό Χ χρωμόσωμα στα αρσενικά ES κύτταρα). Μετά τη διαφοροποίηση υψηλού επιπέδου έκφραση του XIST συμβαίνει μόνο στο αδρανές Χ χρωμόσωμα. Τα διαφοροποιούμενα θηλυκά κύτταρα αυξάνουν την έκφραση του XIST από το αδρανές Χ, πριν την καταστολή της χαμηλού επιπέδου έκφρασης του XIST στο ενεργό Χ χρωμόσωμα. Η μετάβαση από την χαμηλού επιπέδου έκφραση του XIST σε υψηλού επιπέδου έκφραση επιτυγχάνεται μέσω της σταθεροποίησης του XIST RNA στο αδρανές Χ χρωμόσωμα (Panning et al.,1997). Ο ίδιος μηχανισμός ισχύει και στο ποντίκι.

Με τη διαφοροποίηση και την εδραίωση της τυχαίας αδρανοποίησης το XIST/Xist RNA εξαπλώνεται κατά μήκος του Χ χρωμοσώματος και με τη βοήθεια συγκεκριμένων πρωτεϊνών συνδέεται με τη χρωματίνη σε ειδικές περιοχές και προκαλεί τη συμπύκνωσή της. Σημαντικό ρόλο στη διαδικασία αυτή παίζουν και διάφορα φαινόμενα που αφορούν στις ιστόνες. Εδώ δεν θα μας απασχολήσει η διαδικασία της εξάπλωσης, καθώς είναι θέμα επόμενου κεφαλαίου. Ενδεικτικά όμως παρατίθεται η παρακάτω εικόνα που δείχνει την εντόπιση του Xist RNA στο αδρανές Χ χρωμόσωμα.

Η σταθεροποίηση του Xist RNA που αναφέρθηκε παραπάνω, αρχικά θεωρήθηκε ότι οφείλεται στη χρήση εναλλακτικών υποκινητών. Οι Johnston et al., 1998 μετά από πειράματα κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι το σταθερό Xist RNA ξεκινάει από τον υποκινητή Ρ1 και από τον Ρ2 που βρίσκεται 1.5 kb καθοδικά του πρώτου. Από την άλλη το ασταθές Xist RNA ξεκινάει από τον υποκινητή Ρ0 που βρίσκεται 6.5kb ανοδικά του Ρ1. Μια αλλαγή από τον Ρ0 στους Ρ1/Ρ2 στην αρχή της τυχαίας αδρανοποίησης ευθύνεται για την αύξηση και εξάπλωση in cis του σταθερού Xist μεταγράφου από το μελλοντικά αδρανές Χ χρωμόσωμα. Ανάλυση διαγονιδιακών και knockout ES κυτταρικών σειρών έδειξε ότι η μεταγραφή από τον Ρ0 σχετίζεται με την ικανότητα ενός Xist αλληλόμορφου να γίνεται αντιληπτό από το μηχανισμό καταμέτρησης των Χ χρωμοσωμάτων. Τα αποτελέσματα όμως αυτά αμφισβητήθηκαν από μεταγενέστερα πειράματα άλλων επιστημόνων (Warshawsky et al., 1999 κ.ά.), τα οποία έδειξαν ότι ο Ρ0 ήταν στην πραγματικότητα ένα artifact και ότι η μεταγραφή ανοδικά του P1 ξεκινά από την αντίθετη έλικα από αυτή του Xist και η περιοχή αντιπροσωπεύει το 3΄ άκρο του antisense γονιδίου Tsix. Ο μηχανισμός της σταθεροποίησης του Xist RNA και ο ρόλος του γονιδίου Tsix στη διαδικασία αυτή περιγράφεται αναλυτικά στην ενότητα “Το γονίδιο Tsix/TSIX”.

Η σύνδεση του Xist RNA με τις ειδικές περιοχές του χρωμοσώματος Χ και η επακόλουθη συμπύκνωση της χρωματίνης που οδηγεί στην αδρανοποίηση των γονιδίων (ή αλλιώς silencing) είναι δύο λειτουργίες διακριτές που επιτελούνται από δύο διαφορετικές περιοχές του Xist RNA. Πιο συγκεκριμένα οι Wutz et al. (2002) χρησιμοποιώντας ES κύτταρα ποντικού που εξέφραζαν διαφορετικά Xist διαγονίδια, κάτω από τον έλεγχο ενός υποκινητή που προωθούνταν από τετρακυκλίνη, παρατήρησαν ότι η σύνδεση του Xist RNA με τη χρωματίνη και η αδρανοποίηση μπορούσαν να διαχωριστούν από συγκεκριμένες μεταλλάξεις. Η αδρανοποίηση απαιτεί μια συντηρημένη επαναλαμβανόμενη αλληλουχία που βρίσκεται στο 5΄άκρο του Xist. Η αφαίρεση αυτής της αλληλουχίας οδηγεί σε ένα Xist RNA , το οποίο δεν χάνει μεν την ικανότητα σύνδεσής του με τη χρωματίνη και εξάπλωσής του κατά μήκος του χρωμοσώματος Χ, αλλά δεν μπορεί να προκαλέσει τη μεταγραφική καταστολή των γονιδίων στο χρωμόσωμα. Η σύνδεση του Xist RNA με τη χρωματίνη ελέγχεται από λειτουργικά αδρανείς αλληλουχίες που δρουν σε συνεργασία μεταξύ τους και είναι διασκορπισμένες στο υπόλοιπο Xist, αλλά παρουσιάζουν πολύ μικρή ή και καμία ομολογία.

ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΜΕ XIST ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑ

Η J.T.Lee και οι συνεργάτες της εισήγαγαν ένα XIST YAC (Yeast Artificial Chromosome) 450 kb σε αρσενικά ES κύτταρα. Ανέλυσαν τρεις ES κυτταρικές σειρές με το XIST YAC σε πολλαπλά αντίγραφα ενσωματωμένα σε διαφορετικά αυτοσώματα. Όταν αυτές οι διαγονιδιακές ΧΥ ES κυτταρικές σειρές διεγέρθηκαν για να διαφοροποιηθούν παρατηρήθηκε έκτοπη έκφραση του XIST στα αυτοσώματα καθώς και έκφραση του ενδογενούς XIST. Τα επίπεδα της μεταγραφής του XIST ήταν ανάλογα με τον αριθμό των διαγονιδίων. Εφόσον το έκτοπο ή το ενδογενές XIST μπορούν να εκφραστούν, τα στοιχεία που είναι απαραίτητα για την καταμέτρηση και/ή για την επιλογή πρέπει να είναι παρόντα στο διαγονίδιο. Η ανάλυση FISH έδειξε ότι το RNA που προκύπτει από το XIST διαγονίδιο συνδέεται με το αυτόσωμα, στο οποίο το διαγονίδιο έχει εισαχθεί, και μπορεί να αποσιωπήσει ένα lacZ γονίδιο δείκτη in cis.

Οι Lee και Jaenisch μελέτησαν ένα Xist YAC 450 kb που ενσωμάτωσαν στο χρωμόσωμα 12 του ποντικού. Βρήκαν ότι το RNA που προήλθε από το έκτοπο Xist κάλυψε τελείως το χρωμόσωμα 12 και ότι τα γονίδια στο αυτόσωμα, σε μια περιοχή μεγαλύτερη από 50 cM αδρανοποιήθηκαν. Το χρωμόσωμα αντιγράφηκε σε μεταγενέστερο στάδιο της φάσης S από ότι το φυσιολογικό χρωμόσωμα 12 και παρουσίασε υποακετυλίωση της ιστόνης Η4.Αυτή η αναφορά αποδεικνύει ότι μπορεί να συμβεί μακράς διάρκειας in cis αδρανοποίηση στο αυτοσωμικό DNA και ότι ένα διαγονίδιο που περιέχει το Xist μπορεί να αλλάξει τη δομή της χρωματίνης.

Οι Herzing et al. δημιούργησαν μια άλλη διαγονιδιακή σειρά εμβρυϊκών στελεχιαίων κυττάρων χρησιμοποιώντας ένα YAC περίπου 35 kb που περιείχε το Xist. Ανακάλυψαν ότι αυτό το μικρότερο YAC που στερούνταν των περισσοτέρων από τις γειτονικές αλληλουχίες, που είχαν χρησιμοποιηθεί σε προηγούμενες μελέτες, ήταν επαρκές για να προάγει την in cis αδρανοποίηση στο αυτοσωμικό τμήμα του διαγονιδίου και ότι το RNA τύλιγε το αυτόσωμα αυτό. Σε κάποια κύτταρα παρατηρήθηκε επίσης και έκφραση του ενδογενούς Xist, γεγονός που υποδεικνύει ότι το YAC περιείχε το στοιχείο της καταμέτρησης (counting element) μέσα ή πολύ κοντά στο Xist.

Οι Matsuura et al. μελέτησαν ένα YAC 350 kb που ενσωμάτωσαν σε αυτοσώματα και βρήκαν ότι το Xist δεν εκφραζόταν σε δύο σειρές. Παρ’όλα αυτά ένα YAC με μια έλλειψη 110 kb, που ενσωματώθηκε σε μια ετεροχρωματική περιοχή του μακρού βραχίονα του χρωμοσώματος Υ εξέφραζε το έκτοπο Xist με επίπεδα έκφρασης παρόμοια με αυτά σε θηλυκά ποντίκια. Το διαγονίδιο που ενσωματώθηκε σε αυτόσωμα βρέθηκε να είναι υπερμεθυλιωμένο στην 5΄Α περιοχή του Xist, ενώ το ενσωματωμένο στο χρωμόσωμα Υ διαγονίδιο ήταν υπομεθυλιωμένο, δικαιολογώντας την έκφραση του Xist. Αυτά τα αποτελέσματα έρχονται σε αντίθεση με τα αποτελέσματα των Heard et al., που δημιούργησαν διαγονιδιακά ποντίκια με ένα αυτοσωμικά ενσωματωμένο YAC 460 kb, αλλά δεν παρατήρησαν κανένα ίχνος έκφρασης του Xist ούτε στα θηλυκά ούτε στα αρσενικά ποντίκια. Είναι πιθανό οι διαφορές μεταξύ αυτών των αναφορών να οφείλονται σε παράγοντες, όπως είναι η κατασκευή των YACs, η μέθοδος ενσωμάτωσής τους στα κύτταρα και σε άλλες παρόμοιες τεχνικές παραμέτρους. Πρόσφατα οι Heard et al. έδειξαν ότι τα YAC Xist διαγονίδια λειτουργούν μόνο όταν βρίσκονται σε διατάξεις πολλαπλών αντιγράφων (2 – 7 αντίγραφα) και όχι όταν είναι ενσωματωμένα ως μοναδικό αντίγραφο. Τα πολλαπλά αντίγραφα απαιτούνται τόσο για την αδρανοποίηση, όσο και για την καταμέτρηση των Χ χρωμοσωμάτων. Από τη στιγμή που τα διαγονίδια δεν διαφέρουν ως προς την πρωτογενή αλληλουχία, είναι πιθανό ότι κάποιου είδους επαναλαμβανόμενο μοντέλο απαιτείται για τη σωστή αδρανοποίηση του χρωμοσώματος.

ΤΟ ΓΟΝΙΔΙΟ Tsix

To Xic (X-inactivation center), όπως έχει ήδη αναφερθεί, περιέχει αλληλουχίες που ρυθμίζουν τις διαδικασίες της καταμέτρησης των Χ χρωμοσωμάτων, της επιλογής του Χ χρωμοσώματος που θα αδρανοποιηθεί και της έναρξης της αδρανοποίησης.

Σε αυτήν την περιοχή ανακαλύφθηκε το 1999 από τους Lee JT et al. και το γονίδιο Tsix. Το γονίδιο αυτό είναι ένα antisense γονίδιο ως προς το Xist, το οποίο δεν περιέχει ιντρόνια και του οποίου ο κύριος υποκινητής εντοπίζεται 15 kb καθοδικά του γονιδίου Xist. Επίσης περιέχει μια νησίδα CpG στο 5΄άκρο του. Η αλληλουχία του Tsix είναι συντηρημένη στο ανθρώπινο XIC. Όπως και το Xist , το Tsix μεταγράφεται και δίνει ένα RNA 40 kb που επικαλύπτει το γενετικό τόπο του Xist, αλλά το μετάγραφο αυτό δεν περιέχει κανένα συντηρημένο ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF), οπότε δεν μεταφράζεται. Αντίθετα, παραμένει στον πυρήνα και εντοπίζεται αποκλειστικά στην περιοχή του Xic.

Πριν από την έναρξη της αδρανοποίησης, όταν το Xist εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα, παρατηρείται έκφραση του Tsix σε όλα τα Χ χρωμοσώματα τόσο θηλυκών, όσο και αρσενικών κυττάρων. Κατά την έναρξη όμως της αδρανοποίησης η έκφρασή του γίνεται μονοαλληλική, δηλαδή το Tsix RNA εξαφανίζεται από το μελλοντικά αδρανές Χ χρωμόσωμα, στο οποίο η έκφραση του Xist αυξάνεται σε υψηλά επίπεδα, ενώ την ίδια στιγμή συνεχίζει να εκφράζεται στο μελλοντικά ενεργό Χ χρωμόσωμα, όπου η έκφραση του Xist καταστέλλεται.To Tsix έχει χαρακτηριστικά που υποδηλώνουν ότι εμπλέκεται στη ρύθμιση των αρχικών σταδίων της αδρανοποίησης του χρωμοσώματος Χ, αλλά όχι στην ίδια την αδρανοποίηση.

Οι Lee και Lu (1999) δημιούργησαν μια έλλειψη του γονιδίου Tsix σε αρσενικά και θηλυκά κύτταρα ποντικού. Παρά την έλλειψη του Tsix RNA, ο μηχανισμός της καταμέτρησης των Χ χρωμοσωμάτων παρέμεινε ανέπαφος: τα θηλυκά κύτταρα εξακολουθούσαν να αδρανοποιούν το ένα Χ χρωμόσωμα, ενώ τα αρσενικά κύτταρα εμπόδιζαν την αδρανοποίηση. Όμως τα ετερόζυγα ως προς την έλλειψη του Tsix θηλυκά κύτταρα παρουσίασαν επιλεκτική αδρανοποίηση του Χ χρωμοσώματος που έφερε την έλλειψη. Οι ερευνητές κατέληξαν στο ότι το Tsix εμποδίζει την εξάπλωση του Xist RNA in cis και καθορίζει ποιο χρωμόσωμα θα αδρανοποιηθεί, χωρίς όμως να επιδρά στην ίδια την αδρανοποίηση. Έτσι οι διαδικασίες της καταμέτρησης των Χ χρωμοσωμάτων, της επιλογής Χ χρωμοσώματος που θα αδρανοποιηθεί και της αδρανοποίησης του επιλεχθέντος χρωμοσώματος είναι γενετικά διακριτές.

Για να εξετάσει την επίδραση της έλλειψης και του δεύτερου αλληλομόρφου στην επιλογή του Χ χρωμοσώματος που αδρανοποιείται η JT.Lee (2002) δημιούργησε ομόζυγα Tsix- null ποντίκια. Η ομοζυγωτία οδήγησε σε πολύ χαμηλή γονιμότητα και αποκάλυψε δύο άγνωστα μέχρι τώρα μη μενδελιανά μοντέλα κληρονομικότητας. Πρώτον, η αναλογία φύλου στους απογόνους μεταβλήθηκε σε βάρος του θηλυκού φαινοτύπου, έτσι ώστε 1 θηλυκό γεννιόταν για κάθε 2 με 3 αρσενικά. Δεύτερον η αδρανοποίηση του χρωμοσώματος X απροσδόκητα επανήλθε στην τυχαία μορφή της στα επιζώντα ποντίκια που ήταν ομόζυγα για την έλλειψη αυτή. Έτσι, όσο αφορά στην επιλογή του Χ χρωμοσώματος που θα αδρανοποιηθεί, μια μετάλλαξη του Tsix προκαλεί φαινοτυπική ανωμαλία στους ετεροζυγώτες ως προς αυτή τη μετάλλαξη και όχι στους ομοζυγώτες. Για να εξηγήσει το παράδοξο της απώλειας θηλυκών απογόνων σε σχέση με την παρατηρηθείσα μετάβαση στην τυχαία επιλογή του προς αδρανοποίηση Χ χρωμοσώματος η JT.Lee πρότεινε ότι η αφαίρεση και των δύο Tsix αλληλόμορφων οδηγεί σε “χαοτική” επιλογή και ότι η τυχαία αδρανοποίηση στους ομοζυγώτες επιζώντες αντανακλά ένα τυχαίο και απρόσμενο καθορισμό των δύο Χ χρωμοσωμάτων ως αδρανές και ενεργό.

Σύμφωνα με τα πειράματα των Stavropoulos N. et al. (2001) η μεταγραφή του Tsix είναι απαραίτητη για τον περιορισμό της ενεργότητας του γονιδίου Xist στο μελλοντικά ενεργό Χ χρωμόσωμα και αντίστροφα η καταστολή του απαιτείται για την εξάπλωση του Xist RNA in cis στο μελλοντικά αδρανές Χ χρωμόσωμα.

Ποιος όμως είναι ο μηχανισμός με τον οποίο η μεταγραφή του Tsix μπλοκάρει το Xist RNA; Προς το παρόν δεν έχει διευκρινιστεί ο ακριβής μηχανισμός, αλλά έχουν προταθεί από τους επιστήμονες διάφορα μοντέλα δράσης του Tsix. Μπορεί το Xist RNA και το antisense του, δηλαδή το Tsix RNA, να σχηματίζουν μια έλικα, η οποία αποσταθεροποιεί το πρώτο ή/και το εμποδίζει να προσδεθεί με πρωτεΐνες που το φέρνουν σε επαφή με την χρωματίνη και συμβάλλουν στην in cis αδρανοποίηση. Είναι πιθανό επίσης η antisense μεταγραφή να μεταβάλλει τη δομή της χρωματίνης και να εμποδίζει με αυτόν τον τρόπο την σωστή μεταγραφή του Xist ή απλώς να παρεμβαίνει στη μεταγραφή του Xist οδηγώντας στο ίδιο αρνητικό για την έκφραση του γονιδίου αποτέλεσμα. Τα κυριότερα από τα προτεινόμενα μοντέλα παρουσιάζονται στο παρακάτω σχήμα.

Όπως αποδείχθηκε παραπάνω η μεταγραφή του Tsix αποτελεί ανασταλτικό παράγοντα για την μεταγραφή και την εξάπλωση του Xist RNA in cis, δεν επηρεάζει όμως την επιλογή του Χ χρωμοσώματος που θα αδρανοποιηθεί. Η διαδικασία αυτή ρυθμίζεται από στοιχεία που εντοπίζονται μέσα στο Tsix, τα οποία ωστόσο είναι ανεξάρτητα της λειτουργίας των υποκινητών.(Το Tsix, σύμφωνα με την έρευνα των Sado et al. (2001), έχει δύο υποκινητές έναν κύριο που εντοπίζεται 15 kb καθοδικά του Xist και ένα μικρότερο που βρίσκεται ~28 kb καθοδικά του Xist) Πιο συγκεκριμένα η αλληλουχία του DNA στο 5΄άκρο του γονιδίου Tsix θεωρείται ότι καθορίζει την επιλογή, καθώς περιέχει πολλαπλές θέσεις πρόσδεσης του μονωτή και μεταγραφικού παράγοντα CTCF, ο οποίος αναγνωρίστηκε από τους Chao et al. (2002) ως υποψήφιος in trans παράγοντας, υπεύθυνος για την επιλογή του Χ χρωμοσώματος που αδρανοποιείται. Οι θέσεις αυτές πιστεύεται ότι δρουν σαν μονωτές, εμποδίζοντας έναν άγνωστο μέχρι στιγμής ενισχυτή να έρθει σε επαφή με το γονίδιο Xist, αποτρέποντας κατά αυτόν τον τρόπο το γονίδιο να εκφραστεί και να αδρανοποιήσει το χρωμόσωμα. Με άλλα λόγια το γονίδιο Tsix και ο παράγοντας CTCF θεωρείται ότι λειτουργούν σαν ένας ρυθμιστικός επιγενετικός διακόπτης για την αδρανοποίηση του χρωμοσώματος Χ.

Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι το Tsix υπόκειται σε γονιδιακή αποτύπωση στους εξωεμβρυϊκούς ιστούς του ποντικού, ώστε εκφράζεται μόνο από το μητρικό αλληλόμορφο. Έτσι σε κύτταρα, όπου η αδρανοποίηση είναι επιλεκτική, η αφαίρεση ενός αντιγράφου του Tsix θα δημιουργήσει διαφορετικό φαινότυπο μόνο στην περίπτωση που η έλλειψη κληρονομηθεί από τη μητέρα. Αυτό ακριβώς εκμεταλλεύτηκαν πειράματα που έγιναν για την εξακρίβωση του ρόλου του Tsix στην επιλεκτική αδρανοποίηση. Τόσο στα ΧΧ όσο και στα ΧΥ κύτταρα η μετάδοση από τη μητέρα μιας έλλειψης του Tsix κατέληξε σε επανενεργοποίηση του φυσιολογικά υπό καταστολή Xist μητρικού αλληλόμορφου. Το αποτέλεσμα ήταν ότι τα μεταλλαγμένα ΧΧ κύτταρα παρουσίασαν αδρανοποίηση και των δύο Χ χρωμοσωμάτων, ενώ τα μεταλλαγμένα ΧΥ κύτταρα αδρανοποίησαν το μοναδικό τους Χ χρωμόσωμα. Έτσι προέκυψε ότι το Tsix είναι απαραίτητο για την καταστολή του μητρικού Xist αλληλόμορφου στους εξωεμβρυϊκούς ιστούς, όπου το πατρικό Χ χρωμόσωμα είναι αυτό που αδρανοποιείται. Με βάση αυτά τα στοιχεία η Lee JT (2000) και οι Sado et al. (2001) πρότειναν ότι το Tsix είναι εκείνος ο μητρικής έκφρασης παράγοντας που προστατεύει το μητρικό Χ χρωμόσωμα από την αποτυπωμένη (επιλεκτική) αδρανοποίηση στους εξωεμβρυϊκούς ιστούς.

ΤΟ ΓΟΝΙΔΙΟ TSIX

Παραπάνω αναφερθήκαμε στο γονίδιο Tsix που εντοπίζεται στο κέντρο αδρανοποίησης (Xic) του ποντικού. Οι Migeon et al. (2001) χρησιμοποιώντας ES κύτταρα ποντικού που έφεραν ένα διαγονίδιο του ανθρώπινου XIC και εφαρμόζοντας RT-PCR ανακάλυψαν το ομόλογο του Tsix στον άνθρωπο, το οποίο και ονόμασαν TSIX. Το γονίδιο TSIX με in silico ανάλυση αποδείχθηκε ότι δεν περιέχει κανένα ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF) και ότι παρουσιάζει μικρή ομολογία με το Tsix του ποντικού. Πιο συγκεκριμένα η μόνη περιοχή που παρουσιάζει ομολογία μεγαλύτερη από 50% μέσα στο TSIX είναι μια περιοχή στη θέση ~76 kb του XIC κοντά στη θέση έναρξης της μεταγραφής του TSIX. Αυτή είναι πιθανότατα και η περιοχή ομολογίας μεταξύ του Tsix και του ανθρώπινου XIC που παρατήρησαν οι Lee et al. (1999).

Επίσης το γονίδιο TSIX σε αντίθεση με το ομόλογό του, Tsix, δεν έχει νησίδα CpG στο 5΄άκρο του, όπως αναμενόταν. Η έλλειψη αυτή στην αρχή του TSIX υποδηλώνει ότι κατά τη διάρκεια της εξέλιξης προκλήθηκε μια θραύση στην περιοχή αυτή του XIC. Στοιχεία που ενισχύουν την άποψη αυτή προκύπτουν από την ανάλυση ενός γειτονικού γονιδίου, του Tsx (X-linked testis specific gene). Το γονίδιο Tsx που εντοπίζεται 17 kb από το Tsix εκφράζεται στους όρχεις ποντικών, αλλά δεν υπάρχει ομόλογό του που να εκφράζεται στους όρχεις του ανθρώπου(Simmler et al.,1996). Στην πραγματικότητα δεν υπάρχει ανθρώπινο ομόλογο γονίδιο, καθώς μόνο ομόλογα θραύσματα του Tsx υπάρχουν στο ανθρώπινο γονιδίωμα. Οι αλληλουχίες του ανθρώπινου TSX είναι διασκορπισμένες στο ανθρώπινο Χ χρωμόσωμα: το εξώνιο 1 βρίσκεται στην περιοχή Xq23 και το εξώνιο 6 στην περιοχή Xq21. Υπολείμματα των εξωνίων 5 και 4 είναι παρόντα στην περιοχή U80460, αλλά αυτά τα θραύσματα βρίσκονται 13-20 kb και >50 kb από το 5΄άκρο του TSIX αντίστοιχα.

Όπως και το Tsix, το TSIX εκφράζεται μόνο από κύτταρα εμβρυϊκής προέλευσης και όχι από σωματικά κύτταρα ενηλίκου. Ξεκινάει καθοδικά του 3΄άκρου του XIST και παράγει ένα RNA που δεν μεταφράζεται, το TSIX RNA, και το οποίο είναι κατά ένα μέρος antisense ως προς το XIST. To TSIX RNA καλύπτει το μετάγραφο του XIST από το 3΄άκρο του μέχρι και το εξώνιο 5, αλλά όχι και τον υποκινητή του XIST, όπως κάνει το ομόλογό του, Tsix.

Μια ακόμα διαφορά ανάμεσα στο TSIX και το Tsix είναι ότι το πρώτο σε αντίθεση με το δεύτερο δεν φαίνεται να επηρεάζει την έκφραση του XIST. Σε θηλυκά κύτταρα εμβρυϊκής προέλευσης παρατηρήθηκε ταυτόχρονη έκφραση του μεταγράφου του TSIX και του XIST, γεγονός που δεν συνάδει με τη λειτουργία του TSIX ως καταστολέα του XIST. Επίσης εφόσον το TSIX δεν εκφράζεται από τα αρσενικά εμβρυϊκής προέλευσης κύτταρα, το μετάγραφό του δεν σχετίζεται με το ενεργό Χ χρωμόσωμα. Τέλος το TSIX δεν παίζει ρόλο ανάλογο με εκείνο του Tsix στην επιλεκτική αδρανοποίηση, αφού η αδρανοποίηση στους εξωεμβρυϊκούς ιστούς του ανθρώπου είναι τυχαία. Έτσι λοιπόν σύμφωνα με τις σημερινές απόψεις το γονίδιο TSIX του ανθρώπου αποτελεί ένα εξελικτικό υπόλειμμα του γονιδίου Tsix του ποντικού, το οποίο συνεχίζει να εκφράζεται στους εμβρυϊκούς ιστούς, κατά τον ίδιο περίπου τρόπο που το γονίδιο XIST συνεχίζει να εκφράζεται μετά την κρίσιμη για την αδρανοποίηση περίοδο.

Ελεύθερο Ανάγνωσμα - “Ο γενετικός τόπος XIST και τα μικρά δακτυλιοειδή Χ χρωμοσώματα”

Ο σοβαρά παθολογικός φαινότυπος γυναικών, των οποίων ο καρυότυπος περιέχει μικρά δακτυλιοειδή Χ χρωμοσώματα έχει αποδοθεί στην αδυναμία του αυτού του τύπου χρωμοσώματος να αδρανοποιηθεί. Οι Migeon et al. (1993) με τα πειράματά τους έδωσαν ισχυρές αποδείξεις που ενισχύουν αυτή την άποψη. Χρησιμοποιώντας PCR, αποτύπωση κατά Southern και in situ υβριδισμό εξέτασαν μικρά δακτυλιοειδή χρωμοσώματα, τα οποία προέρχονταν από 8 γυναίκες με συγγενείς δυσπλασίες και σοβαρή διανοητική καθυστέρηση, ως προς την ύπαρξη του γενετικού τόπου XIST. Παρατήρησαν ότι μερικά δακτυλιοειδή χρωμοσώματα δεν περιείχαν αυτόν το γενετικό τόπο, ενώ άλλα περιείχαν αλληλουχίες ομόλογες ως προς δείκτες για το XIST. Παρ’ όλα αυτά, με RT-PCR διαπιστώθηκε ότι στην τελευταία ομάδα ο γενετικός τόπος είτε δεν εκφραζόταν, είτε εκφραζόταν σε ασήμαντο βαθμό. Καθώς η μεταγραφή του XIST αποτελεί δείκτη της αδρανούς κατάστασης του χρωμοσώματος Χ, η απουσία της μεταγραφής του υποδηλώνει ότι τα μικρά δακτυλιοειδή χρωμοσώματα σε γυναίκες με παθολογικό φαινότυπο είναι μεταλλαγμένα όσο αφορά στη διαδικασία της αδρανοποίησης και ότι η αδυναμία αυτών των χρωμοσωμάτων να αδρανοποιηθούν είναι το αίτιο αυτού του παθολογικού φαινοτύπου. Επίσης οι Migeon et al. βρήκαν ότι τρεις Χ-συνδεδεμένοι γενετικοί τόποι, οι AR, TIMP και PHKA1, εκφράζονταν στα δακτυλιοειδή χρωμοσώματα δύο ατόμων, γεγονός που σημαίνει ότι αυτά τα δύο χρωμοσώματα ήταν ενεργά. Επιπλέον τα χρωμοσώματα είχαν ενεργή χρωματίνη, όπως προέκυψε με σήμανση με την ακετυλιωμένη ιστόνη Η4. Αυτό θεωρήθηκε ως καθαρή απόδειξη ότι τα δακτυλιοειδή χρωμοσώματα αντιπροσωπεύουν χρωμοσωμικές μεταλλάξεις που επηρεάζουν την αδρανοποίηση in cis και ότι ο σοβαρός παθολογικός φαινότυπος οφείλεται σε λειτουργική δισωμία που προέρχεται από την έλλειψη αντιστάθμισης δόσης για τα γονίδια που είναι παρόντα στο δακτυλιοειδές χρωμόσωμα. Τέλος δύο άλλα άτομα έφεραν στα δακτυλιοειδή τους χρωμοσώματα τις κωδικές αλληλουχίες του XIST, στοιχείο που οδηγεί στο συμπέρασμα ότι αυτές οι αλληλουχίες από μόνες τους δεν είναι επαρκείς για την επίτευξη της αδρανοποίησης. Είναι πιθανό λοιπόν τα σημεία θραύσης κατά το σχηματισμό αυτών των χρωμοσωμάτων να απομονώνουν γειτονικά ρυθμιστικά στοιχεία ή αλληλουχίες που δρουν ως ενισχυτές.

ΒΙΒΛΙΑ

1. Αγγελοπούλου Ρ., “Πειραματική Εμβρυολογία”, Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ.Πασχαλίδης
2. AlbertsB. et al, “Βασικές Αρχές Κυτταρικής Βιολογίας”, Ιατρικές εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης 2000
3. Alberts B. et al: “Molecular Biology of the cell”, Garland Publishing, Inc.1998
4. Lewin B.,“Genes VI” Oxford University Press 2000
5. Gelehrter T. D. & Collins F. S., “Αρχές Ιατρικής Γενετικής”, Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ.Πασχαλίδης 1996

ΑΡΘΡΑ

1. Avner, P. & Heard, E.: X-chromosome inactivation: counting, choice and initiation. Nature Reviews Genetics 2, 59-67, 2001. 
2. Avner, P. & Heard, E.: Anti-Xistentialism, Nature Genetics, Vol. 21, April 1999.
3. Borsani, G.; Tonlorenzi, R.; Simmler, M. C.; Dandolo, L.; Arnaud, D.; Capra, V.; Grompe, M.; Pizzuti, A.; Muzny, D.; Lawrence, C.; Willard, H. F.; Avner, P.; Ballabio, A.: Characterization of a murine gene expressed from the inactive X chromosome. Nature 351: 325-329, 1991.
4. Boumil, R. M.; Lee, J. T.: Forty years of decoding the silence in X-chromosome inactivation. Hum. Mol. Genet. 10: 2225-2232, 2001
5. Brockdorff, N.; Ashworth, A.; Kay, G. F.; Cooper, P.; Smith, S.; McCabe, V. M.; Norris, D. P.; Penny, G. D.; Patel, D.; Rastan, S.: Conservation of position and exclusive expression of mouse Xist from the inactive X chromosome. Nature 351: 329-331, 1991.
6. Brockdorff, N.; Ashworth, A.; Kay, G. F.; McCabe, V. M.; Norris, D. P.; Cooper, P. J.; Swift, S.; Rastan, S.: The product of the mouse Xist gene is a 15 kb inactive X-specific transcript containing no conserved ORF and located in the nucleus. Cell 71: 515-526, 1992.
7. Brown, C. J.; Ballabio, A.; Rupert, J. L.; Lafreniere, R. G.; Grompe, M.; Tonlorenzi, R.; Willard, H. F.: A gene from the region of the human X inactivation centre is expressed exclusively from the inactive X chromosome. Nature 349: 38-44, 1991.
8. Brown, C. J.; Hendrich, B. D.; Rupert, J. L.; Lafreniere, R. G.; Xing, Y.; Lawrence, J.; Willard, H. F.: The human XIST gene: analysis of a 17 kb inactive X-specific RNA that contains conserved repeats and is highly localized within the nucleus. Cell 71: 527-542, 1992.
9. Brown, C. J.; Lafreniere, R. G.; Powers, V. E.; Sebastio, G.; Ballabio, A.; Pettigrew, A. L.; Ledbetter, D. H.; Levy, E.; Craig, I. W.; Willard, H. F.: Localization of the X inactivation centre on the human X chromosome in Xq13. Nature 349: 82-84, 1991.
10. Brown, C. J.; Robinson, W. P.: XIST expression and X-chromosome inactivation in human preimplantation embryos. (Editorial) Am. J. Hum. Genet. 61: 5-8, 1997.
11. Brown, C. J.; Willard, H. F.: Localization of the X inactivation center (XIC) to Xq13. (Abstract) Cytogenet. Cell Genet. 51: 971, 1989.
12. Carrel, L;Willard, H. F.: Counting on Xist. Nature Genet. 19: 211-212, 1998.
13. Cattanach, B. M.; Perez, J. N.; Pollard, C. E.: Controlling elements in the mouse X-chromosome. II. Location in the linkage map. Genet. Res. 15: 183-195, 1970.
14. Chao, W.; Huynh, K. D.; Spencer, R. J.; Davidow, L. S.; Lee, J. T.: CTCF, a candidate trans-acting factor for X-inactivation choice. Science 295: 345-347, 2002.
15. Clerc, P.; Avner, P.: Role of the region 3-prime to Xist exon 6 in the counting process of X-chromosome inactivation. Nature Genet. 19: 249-253, 1998
16. Daniels, R.; Zuccotti, M.; Kinis, T.; Serhal, P.; Monk, M.: XIST expression in human oocytes and preimplantation embryos. Am. J. Hum. Genet. 61: 33-39, 1997.
17. Goto, T.; Wright, E.; Monk, M.: Paternal X-chromosome inactivation in human trophoblastic cells. Molec. Hum. Reprod. 3: 77-80, 1997.
18. Hendrich BD, Plenge RM and Willard HF Identification and characterization of the human XIST gene promoter: implications for models of X chromosome inactivation. Nucleic Acids Res. 25: 2661-2671,1997.
19. Hong YK; Ontiveros SD; Strauss WM. A revision of the human XIST gene organization and structural comparison with mouse Xist. Mammalian Genome Mar; 11(3): 220-4, 2000.
20. Horn, J. M.; Ashworth, A.: A member of the caudal family of homeobox genes maps to the X-inactivation centre region of the mouse and human X chromosomes. Hum. Molec. Genet. 4: 1041-1047, 1995.
21. Johnston, C. M.; Nesterova, T. B.; Formstone, E. J.; Newall, A. E. T.; Duthie, S. M.; Sheardown, S. A.; Brockdorff, N.: Developmentally regulated Xist promoter switch mediates initiation of X inactivation. Cell 94: 809-817, 1998.
22. Kay, G. F.; Penny, G. D.; Patel, D.; Ashworth, A.; Brockdorff, N.; Rastan, S.: Expression of Xist during mouse development suggests a role in the initiation of X chromosome inactivation. Cell 72: 171-182, 1993.
23. Lee J. T.; Strauss William; Dausman J.; Jaenrich Rudolf. : A 450 kb Transgene Displays Properties of the Mammalian X-Inactivation Center. Cell.86: 83-94, 1996
24. Lee, J. T.; Lu, N.: Targeted mutagenesis of Tsix leads to nonrandom X inactivation. Cell 99: 47-57, 1999.
25. Lee, J. T.; Davidow, L. S.; Warshawsky, D.: Tsix, a gene antisense to Xist at the X-inactivation centre. Nature Genet. 21: 400-404, 1999.
26. Lee, J. T.: Disruption of imprinted X inactivation by parent-of-origin effects at Tsix. Cell 103: 17-27, 2000.
27. Lee, J. T.: Homozygous Tsix mutant mice reveal a sex-ratio distortion and revert to random X-inactivation. Nature Genet. 32: 195-200, 2002.
28. Marahrens, Y.; Loring, J.; Jaenisch, R.: Role of the Xist gene in X chromosome choosing. Cell 92: 657-664, 1998.
29. Marahrens, Y.; Panning, B.; Dausman, J.; Strauss, W.; Jaenisch, R.: Xist-deficient mice are defective in dosage compensation but not spermatogenesis. Genes Dev. 11: 156-166, 1997.
30. Matsui, J.; Goto, Y.; Takagi, N.: Control of Xist expression for imprinted and random X chromosome inactivation in mice. Hum. Molec. Genet. 10: 1393-1401, 2001.
31. Mattei, M. G.; Mattei, J. F.; Vidal, I.; Giraud, F.: Structural anomalies of the X chromosome and inactivation center. Hum. Genet. 56: 401-408, 1981.
32. Migeon, B. R.; Lee, C. H.; Chowdhury, A. K.; Carpenter, H.: Species differences in TSIX/Tsix reveal the roles of these genes in X-chromosome inactivation. Am. J. Hum. Genet. 71: 286-293, 2002.
33. Migeon, B. R.; Chowdhury, A. K.; Dunston, J. A.; McIntosh, I.: Identification of TSIX, encoding an RNA antisense to human XIST, reveals differences from its murine counterpart: implications for X inactivation. Am. J. Hum. Genet. 69: 951-960, 2001.
34. Migeon, B. R.: Non-random X chromosome inactivation in mammalian cells. Cytogenet. Cell Genet. 80: 142-148, 1998.
35. Migeon, B. R.; Jeppesen, P.; Torchia, B. S.; Fu, S.; Dunn, M. A.; Axelman, J.; Schmeckpeper, B. J.; Fantes, J.; Zori, R. T.; Driscoll, D. J.: Lack of X inactivation associated with maternal X isodisomy: evidence for a counting mechanism prior to X inactivation during human embryogenesis. Am. J. Hum. Genet. 58: 161-170, 1996.
36. Migeon, B. R.; Luo, S.; Jani, M.; Jeppesen, P.: The severe phenotype of females with tiny ring X chromosomes is associated with inability of these chromosomes to undergo X inactivation. Am. J. Hum. Genet. 55: 497-504, 1994.
37. Migeon, B. R.; Luo, S.; Stasiowski, B. A.; Jani, M.; Axelman, J.; Van Dyke, D. L.; Weiss, L.; Jacobs, P. A.; Yang-Feng, T. L.; Wiley, J. E.: Deficient transcription of XIST from tiny ring X chromosomes in females with severe phenotypes. Proc. Nat. Acad. Sci. 90: 12025-12029, 1993.
38. Morey, C.; Arnaud, D.; Avner, P.; Clerc, P.: Tsix-mediated repression of Xist accumulation is not sufficient for normal random X inactivation. Hum. Molec. Genet. 10: 1403-1411, 2001.
39. Nesterova TB, Slobodyanyuk SY, Elisaphenko EA, Shevchenko AI, Johnston C, Pavlova ME, Rogozin IB, Kolesnikov NN, Brockdorff N and Zakian SM: Characterization of the genomic Xist locus in rodents reveals conservation of overall gene structure and tandem repeats but rapid evolution of unique sequence. Genome Res. 11:833-849, 2001.
40. Panning, B.; Dausman, J.; Jaenisch, R.: X chromosome inactivation is mediated by Xist RNA stabilization. Cell 90: 907-916, 1997.
41. Penny, G. D.; Kay, G. F.; Sheardown, S. A.; Rastan, S.; Brockdorff, N.: Requirement for Xist in X chromosome inactivation. Nature 379: 131-137, 1996.
42. Plath K., Mlynarczyk-Evans S., Nusinow D. A., Panning B.: XIST RNA and the mechanism of X Chromosome Inactivation. Annu. Rev. Genet., January 1, 2002; 36(1): 233 - 278.
43. Plenge, R. M.; Hendrich, B. D.; Schwartz, C.; Arena, J. F.; Naumova, A.; Sapienza, C.; Winter, R. M.; Willard, H. F.: A promoter mutation in the XIST gene in two unrelated families with skewed X-chromosome inactivation. Nature Genet. 17: 353-356, 1997.
44. Ray, P. F.; Winston, R. M. L.; Handyside, A. H.: XIST expression from the maternal X chromosome in human male preimplantation embryos at the blastocyst stage. Hum. Molec. Genet. 6: 1323-1327, 1997.
45. Stavropoulos N., Lu N. and Lee j.: A Functional Role for Tsix Transcription in Blocking Xist RNA Accumulation but Not in X-Chromosome Choice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 10232-10237
46. Therman, E.; Sarto, G. E.; Palmer, C. G.; Kallio, H.; Denniston, C.: Position of the human X inactivation center on Xq. Hum. Genet. 50: 59-64, 1979.
47. Therman, E.; Sarto, G. E.; Patau, K.: Center for Barr body condensation of the proximal part of the human Xq: a hypothesis. Chromosoma 44: 361-366, 1974.
48. Willard HF, Lawrence J, Xing Y, Lafreniere RG, Rupert JL, Hendrich BD and Brown CJ The human XIST gene: Analysis of a 17 kb inactive X-specific RNA that contains conserved repeats and is highly localized within nucleus. Cell 71: 515-529, 1992.
49. Willard HF; Carrel L.: Making sense (and antisense) of the X inactivation center. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 98, Issue 18, 10025-10027, August 28, 2001.
50. Wutz, A.; Rasmussen, T. P.; Jaenisch, R.: Chromosomal silencing and localization are mediated by different domains of Xist RNA. Nature Genet. 30: 167-174, 2002.

Εργασία που παρουσιάστηκε από τη φοιτήτρια Ιατρικής Χρήστου Μαρία-Βασιλική
στα πλαίσια του κατ'επιλογήν μαθήματος της Πειραματικής Εμβρυολογίας
Υπεύθυνη μαθήματος : Ρωξάνη Αγγελοπούλου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια
Εργαστήριο Ιστολογίας και Εμβρυολογίας
Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών
Για περισσότερες πληροφορίες μπορείτε να ανατρέξετε στον ιστότοπο του μαθήματος της Πειραματικής Εμβρυολογίας: http://www.med.uoa.gr/expembr/
Τελευταία αναθεώρηση : 1/5/2006