2.2 ΑΔΡΑΝΟΠΟΙΗΣΗ ΣΤΑ ΣΩΜΑΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ & ΦΑΣΕΙΣ ΤΗΣ ΑΔΡΑΝΟΠΟΙΗΣΗΣ

ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ

Η αδρανοποίηση του χρωμοσώματος Χ είναι ένα φαινόμενο του οποίου η ύπαρξη ανακαλύφθηκε σχετικά πρόσφατα, κατά το δεύτερο μισό του περασμένου αιώνα . Ως γνωστόν, αδρανοποίηση του χρωμοσώματος Χ παρατηρείται στα θηλυκά σωματικά και γαμετικά κύτταρα που περιέχουν δύο τουλάχιστον Χ χρωμοσώματα και είναι μία διαδικασία η οποία χωρίζεται σε τρεις φάσεις ή στάδια . Οι φάσεις αυτές είναι κατά σειρά πραγματοποίησης τους οι εξής: α) έναρξη, β) εξάπλωση και γ) διατήρηση αδρανοποίησης. Η έναρξη της αδρανοποίησης όπως έχει ήδη αναφερθεί ξεκινά από το κέντρο αδρανοποίησης του χρωμοσώματος Χ (ΧΙC: άνθρωπος, Χic: ποντίκι) το οποίο βρίσκεται στη ζώνη Xq13 και μεταξύ των γονιδίων PHKA1 και PGK1 . Η εξάπλωση της αδρανοποίησης του Χ χρωμοσώματος γίνεται με τη βοήθεια του RNA μεταγράφου του γονιδίου XIST για τον άνθρωπο και του γονιδίου Xist για το ποντίκι, τα οποία εντοπίζονται στα αντίστοιχα κέντρα αδρανοποίησης (XIC/Xic), καθώς και με την επιστράτευση ορισμένων ακόμη μορίων, όπως θα δούμε παρακάτω. Τέλος, η διατήρηση της αδρανοποίησης μπορεί να επιτευχθεί με διάφορους μηχανισμούς, οι οποίοι συνιστούν κατά κύριο λόγο χημική παρέμβαση στο μόριο του DNA του χρωμοσώματος Χ που έχει αδρανοποιηθεί και οι οποίοι θα αναλυθούν αργότερα .

Πριν ξεκινήσει η περαιτέρω παρουσίαση και ανάλυση των φάσεων της αδρανοποίησης , είναι σημαντικό να διευκρινιστεί πως τα δεδομένα που θα παρατεθούν προέκυψαν από μελέτες που αφορούσαν σωματικά κύτταρα θηλυκών ποντικών. Σε ορισμένα σημεία, όπου θα δοθούν πληροφορίες που αφορούν τον άνθρωπο, θα υπάρξουν διευκρινίσεις.

Α) ΠΡΩΤΗ ΦΑΣΗ: ΕΝΑΡΞΗ ΤΗΣ ΑΔΡΑΝΟΠΟΙΗΣΗΣ

Στην πρώτη φάση, την έναρξη, γίνεται η επιλογή του Χ χρωμοσώματος που θα υποστεί την αδρανοποίηση. Για την επιτέλεση της επιλογής αυτής είναι απολύτως απαραίτητη η ύπαρξη ενός μοναδικού γονιδιακού τόπου, όπως αναφέρθηκε και στο εισαγωγικό σημείωμα, του κέντρου αδρανοποίησης του Χ χρωμοσώματος Xic (X-inactivation center). Ένα σήμα “έναρξης” πιστεύεται ότι προκαλεί την εκκίνηση της αλληλουχίας των γεγονότων που θα οδηγήσουν στην πραγματοποίηση της αδρανοποίησης. Όπως αναφέρθηκε στο κεφάλαιο που πραγματεύεται τα γενικά χαρακτηριστικά της αδρανοποίησης, υπάρχει ένας μηχανισμός (counting mechanism) ο οποίος αποτελεί βεβαίωση ότι μόνο ένα Χ χρωμόσωμα θα παραμείνει ενεργό σε ένα διπλοειδικό κύτταρο, ενώ όλα τα άλλα θα αδρανοποιηθούν. Ο μηχανισμός αυτός εικάζεται πως στηρίζεται σ’ ένα σήμα “παρεμπόδισης” (blocking signal), το οποίο παράγεται σε περιορισμένες ποσότητες και “δένεται” στο κέντρο αδρανοποίησης ενός μόνο Χ χρωμοσώματος ανά διπλοειδικό κύτταρο (αφού η μικρή του ποσότητα δεν του επιτρέπει να επηρεάζει άλλα κέντρα αδρανοποίησης), προστατεύοντάς το από την αδρανοποίηση. Η φύση του σήματος αυτού παραμένει μέχρι στιγμής άγνωστη. Διάφορες προτάσεις που έχουν γίνει κατά καιρούς , παρουσιάζουν μεγάλη ποικιλία λύσεων του αινίγματος, συμπεριλαμβανομένης αυτής του επισώματος ( επικουρικό αντιγραφικό γενετικό στοιχείο που βρίσκεται είτε αυτόνομο, είτε προσκολλημένο σε κάποιο χρωμόσωμα), μορίου προσκολλημένου σε συγκεκριμένη θέση στο κύτταρο ή μιας “μοναδικής οντότητας πληροφόρησης” (single informational entity). Πιο πρόσφατα μοντέλα κάνουν λόγο για συνεργατική πρόσδεση μορίων ενεργοποιητών (activator molecules). Τα τελευταία χρόνια όμως, όπως αναλύεται εκτενώς στο κεφάλαιο 1.2, η παρουσία ενός γονιδίου, του Tsix, φαίνεται πως είναι υπεύθυνη για την έναρξη της αδρανοποίησης. Μεταγραφή του γονιδίου αυτού οδηγεί στην αναστολή της μεταγραφής του γονιδίου Xist στο ενεργό Χ χρωμόσωμα, ενώ το αντίστροφο ισχύει για το ανενεργό Χ χρωμόσωμα (βλέπε κεφάλαιο 1.2).

Β) ΔΕΥΤΕΡΗ ΦΑΣΗ: ΕΞΑΠΛΩΣΗ ΤΗΣ ΑΔΡΑΝΟΠΟΙΗΣΗΣ

Η εξάπλωση της αδρανοποίησης του χρωμοσώματος Χ είναι ένα από τα στάδια του φαινομένου της αδρανοποίησης που έχει μελετηθεί εκτενέστερα και τα στοιχεία για τους μηχανισμούς που το διέπουν είναι σαφώς πολυπληθέστερα, πιο ακριβή και πιο τεκμηριωμένα. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, για την εξάπλωση του σήματος της αδρανοποίησης είναι απαραίτητη η παρουσία του Xist RNA (ποντίκι), το οποίο δρα in cis, δηλαδή βοηθά στην αδρανοποίηση του χρωμοσώματος από το οποίο μεταγράφεται και μόνο σ’αυτή.

Η εξάπλωση αυτή του σήματος έχει ως αποτέλεσμα τη συμπύκνωση της χρωματίνης και την απενεργοποίηση του μεγαλύτερου αριθμού των γονιδίων του χρωμοσώματος Χ. Το αδρανοποιημένο πλέον χρωμόσωμα βρίσκεται υπό τη μορφή ετεροχρωματίνης, (πολύ συμπυκνωμένης χρωματίνης που εμποδίζει την έκφραση των γονιδίων), γνωστής σε αυτή την περίπτωση και ως σωμάτιο Barr, πολύ κοντά στον πυρηνικό φάκελο, σε αντίθεση με τα υπόλοιπα χρωμοσώματα τα οποία εντοπίζονται διασκορπισμένα στον πυρήνα. Στον άνθρωπο είναι γνωστά 34 γονίδια τα οποία διαφεύγουν της αδρανοποίησης κυρίως στις ψευδοαυτοσωμικές περιοχές PAR1 και PAR2, αλλά και εκτός αυτών (KAL1 και STS), καθώς και το γονίδιο ENOX το οποίο εντοπίζεται μόλις 10 Kb μακριά από το XIC σε ένα υπομεθυλιωμένο νησίδιο CpG. Στο ποντίκι υπάρχουν μόνο δύο ενεργά γονίδια στο αδρανοποιημένο χρωμόσωμα Χ, το Sts και το Smcx, των οποίων τα αντίστοιχα στον άνθρωπο (STS,SMCX), είναι επίσης ενεργά. Εντούτοις, ο μηχανισμός εξάπλωσης της αδρανοποίησης θεωρείται αρκετά αποτελεσματικός λαμβάνοντας υπόψη ότι δρα απενεργοποιώντας ακόμα και γονίδια τα οποία βρίσκονται μετά από μια περιοχή διαφυγής (περιοχής που διαφεύγει της αδρανοποίησης) ή γονίδια αυτοσωμάτων μετά από μετάθεση Χ/αυτοσώματος, καθώς και διαγονίδια τα οποία έχουν ενσωματωθεί στο Χ (βλέπε ελεύθερο ανάγνωσμα).

Μπορούμε να συμπεράνουμε επομένως ότι η εξάπλωση της αδρανοποίησης του Χ χρωμοσώματος είναι μία διαδικασία η οποία έχει τη δυνατότητα να πραγματοποιείται ‘’καθ΄άλματα’’, δηλαδή ακόμα και όταν παρεμβάλλονται περιοχές που διαφεύγουν της αδρανοποίησης, είναι με άλλα λόγια “κατά τόπους ασυνεχής”. Το γεγονός αυτό αποδεικνύεται και με βάση μελέτες ασθενών στους οποίους παρατηρήθηκε διπλασιασμός της τελικής ζώνης του τμήματος Xq. Τα γονίδια της ζώνης αυτής παρέμειναν ανενεργά ακόμα και όταν σε ορισμένους ασθενείς πραγματοποιήθηκε μετάθεσή τους στην περιοχή PAR2, η οποία όπως έχει προαναφερθεί δεν υπόκειται σε αδρανοποίηση.

Όσον αφορά το μηχανισμό της εξάπλωσης αυτό καθ’εαυτό, υπήρξαν διάφορα προτεινόμενα μοντέλα τα οποία αφορούσαν και κάποιες φορές και την περίπτωση της μετάθεσης Χ/αυτοσώματος. Τα πιο σημαντικά ήταν το μοντέλο της ΟΛΙΚΗΣ αδρανοποίησης της Mary F.Lyon (1961) και το μοντέλο της ΜΕΡΙΚΗΣ αδρανοποίησης της Russell. Σήμερα, είναι πλέον σε γενικές γραμμές αποδεκτό το μοντέλο του Riggs, γνωστό στη διεθνή βιβλιογραφία ως “Way-station Model”. Με βάση αυτό το μοντέλο λοιπόν, θα αναλυθεί αμέσως παρακάτω ο μηχανισμός εξάπλωσης της αδρανοποίησης στο Χ χρωμόσωμα.

WAY-STATION MODEL

Το μοντέλο αυτό προϋποθέτει την ύπαρξη ειδικών πρωτεϊνών (RNA δεσμευτικές πρωτεΐνες) σε ορισμένες θέσεις πάνω στο Χ χρωμόσωμα, οι οποίες βοηθούν στη σταθεροποίηση της συμπύκνωσης της χρωματίνης. Σε περιοχές του Χ χρωμοσώματος που διαφεύγουν της αδρανοποίησης παρατηρείται είτε απουσία των πρωτεϊνών αυτών, είτε μη ενεργός μορφή. Εκτός από τις ειδικές αυτές πρωτεΐνες, το μοντέλο του Riggs θέτει προαπαιτούμενο για την αδρανοποίηση μιας περιοχής, την ύπαρξη ειδικών θέσεων δέσμευσης στην περιοχή αυτή. Οι θέσεις αυτές ονομάζονται “θέσεις δέσμευσης υψηλής συγγένειας”, γνωστές διεθνώς και ως “way-station elements” ή “booster elements” ή αλληλουχίες “Line” ή “Line1”. Πρόκειται για ειδικές αλληλουχίες DNA, οι οποίες βρίσκονται διασκορπισμένες κατά μήκος του χρωμοσώματος Χ και διευκολύνουν, όπως θα δούμε αμέσως παρακάτω, την εξάπλωση της αδρανοποίησης.

Στη φάση αυτή, όπως έχει ήδη αναφερθεί, έχουμε τη μεταγραφή του Xist RNA από το γονίδιο Xist, το οποίο βρίσκεται στο κέντρο αδρανοποίησης (Xic). Ο Riggs προτείνει δύο τρόπους εξάπλωσης (εικόνα 2.2.1), σύμφωνα με τις παραπάνω αποδοχές και με τα δεδομένα που προέκυψαν απ’ τις μελέτες του, πιστεύοντας πως ο πραγματικός μηχανισμός δεν απέχει πολύ από κάποιον εκ των δύο. Με βάση τον πρώτο τρόπο εξάπλωσης, το Xist RNA δεσμεύεται in cis με τις πρωτεΐνες των θέσεων δέσμευσης υψηλής συγγένειας, μέσω του συμπλέγματος RNA-πρωτεΐνη-DNA. Με βάση το δεύτερο τρόπο εξάπλωσης, το Xist RNA μεταφέρεται από τις RNA-δεσμευτικές πρωτεΐνες στις θέσεις δέσμευσης υψηλής συγγένειας. Τελικά, και στις δύο περιπτώσεις έχουμε δημιουργία συμπλέγματος RNA/DNA/πρωτεΐνη κοντά στο Xic, το οποίο επιφέρει ,τοπικά, αλλαγές στη διαμόρφωση της χρωματίνης, διευκολύνοντας μ’ αυτό τον τρόπο την εξάπλωση της αδρανοποίησης μακρύτερα απ’ το κέντρο αδρανοποίησης, στο Χ χρωμόσωμα. Στις περιοχές του χρωμοσώματος Χ που παραμένουν ενεργές, έχει παρατηρηθεί πως είτε δεν υπάρχουν θέσεις δέσμευσης υψηλής συγγένειας, είτε αν υπάρχουν, προστατεύονται λόγω της σύνδεσής τους με άλλα στοιχεία, με αποτέλεσμα να μην είναι δυνατή η δημιουργία του συμπλέγματος.

Σ΄ αυτή την εικόνα παρουσιάζεται αναλυτικά η πλήρης αλληλουχία των γεγονότων, τα οποία θα οδηγήσουν στην αδρανοποίηση. Αρχικά το Xist RNA δρα, όπως περιγράφηκε παραπάνω (μοντέλο Riggs), in cis, και προς τις δύο κατευθύνσεις έχοντας ως αφετηρία το κέντρο αδρανοποίησης, “αλληλεπιδρώντας” με τις αλληλουχίες LINE ( ή ορθότερα LINE1), οδηγώντας στη δημιουργία του συμπλέγματος RNA/DNA/πρωτεΐνη. Έτσι, το Xist RNA αρχίζει μέσω του συμπλέγματος να εξαπλώνεται, “σκεπάζοντας” το Χ χρωμόσωμα σε όλο το μήκος του και δημιουργώντας το διεθνώς αποκαλούμενο “μοριακό κλουβί” (molecular cage- εικόνα). Στην εικόνα 2.2.1 φαίνεται ο ακριβής τρόπος αλληλεπίδρασης του Xist RNA με τις αλληλουχίες LINE, σύμφωνα πάντα με τον Riggs. Ο τελευταίος υιοθετεί την άποψη ότι με αφετηρία το κέντρο αδρανοποίησης Xic, ένα περιοριστικό ένζυμο “γυρίζει” στο DNA μέχρι να φτάσει σε μία γειτονική αλληλουχία LINE απ΄ όπου προκαλείται περαιτέρω συνέχιση αυτής της διαδικασίας. Αυτή η διαδικασία μπορεί να γίνει και προς τις δύο κατευθύνσεις, σύμφωνα με τα όσα έχουν ήδη λεχθεί. Το αποτέλεσμα είναι η περιέλιξη του DNA ( type 1 DNA reeling), η οποία θα φέρει κοντά τις περιοχές που έχουν δημιουργήσει τη σκαλωσιά της παρατηρούμενης αγκύλης (εικόνα 2.2.1). Μ’ αυτό τον τρόπο, ξεκινά σταδιακά η συμπύκνωση της χρωματίνης, η οποία φαίνεται πως ολοκληρώνεται με την επιστράτευση της ασυνήθους ιστόνης macroH2A ( συγκεκριμένα των macroH2A1 και macroH2A2) και την υποακετυλίωση των ιστονών H3 και H4 κυρίως (καθώς και για την Η2Α), για τις οποίες θα γίνει ιδιαίτερη αναφορά στην τρίτη φάση της αδρανοποίησης. Πιο συγκεκριμένα, παρατηρείται υπερσυγκέντρωση της macroH2A ,η οποία φαίνεται στην εικόνα 2.2.2, ενώ η υποακετυλίωση συμμετέχει τόσο στην εξάπλωση, όσο και στη διατήρηση της αδρανοποίησης

ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΗΣ ΕΞΑΠΛΩΣΗΣ

Σ’ αυτό το σημείο, μπορούμε να δούμε συγκεντρωμένα τα κύρια χαρακτηριστικά της εξάπλωσης της αδρανοποίησης στο χρωμόσωμα Χ:

• Πρόκειται για μηχανισμό αποτελεσματικό

Παρατηρείται

• σταδιακή συμπύκνωση της χρωματίνης του χρωμοσώματος Χ που υφίσταται την αδρανοποίηση & τελικά, δημιουργία του σωματίου Barr
• αργοπορία στην αντιγραφή των γονιδίων του ανενεργού Χ χρωμοσώματος
• μεταγραφή του Xist RNA, αλλά όχι μετάφραση αυτού
• υποακετυλίωση ιστονών (H2A, H3, H4)
• υψηλή συγκέντρωση της ασυνήθους ιστόνης macroH2A

Καθώς και:

• μεθυλίωση των C των νησιδίων CpG (ο ρόλος της στην αδρανοποίηση θα αναλυθεί εκτενώς σε ιδιαίτερο κεφάλαιο, ενώ σ’ αυτό το κεφάλαιο θα αναφερθεί σε γενικές γραμμές η συμμετοχή της στη διατήρηση της αδρανοποίησης).

ΙΣΤΟΝΗ macroH2A

Η ιστόνη macroH2A αποτελεί παραλλαγή της ιστόνης Η2Α, γνωστής σε όλους από τη συμμετοχή της στη δημιουργία της δομής του νουκλεοσώματος. Πρόκειται ουσιαστικά για μία οικογένεια πρωτεϊνών των 42kDa περίπου, η οποία συναντάται με τα δύο μέλη της, την ιστόνη macroH2A1 (με δύο περαιτέρω μέλη: macroH2A1.1 και macroH2A1.2) και την macroH2A2. Οι δύο αυτές πρωτεΐνες κωδικοποιούνται από ξεχωριστά γονίδια. Στον άνθρωπο τα γονίδια για τις πρωτεΐνες macroH2A1.1 και macroH2A1.2 βρίσκονται στο χρωμόσωμα 5 (προκύπτουν από τον εναλλακτικό συνδυασμό εξωνίων κατά τη συρραφή αυτών), ενώ το γονίδιο για την macroH2A2 εδράζεται στο χρωμόσωμα 10. Σχετικά με το ποντίκι, είναι σίγουρα γνωστό πως το γονίδιο της ιστόνης macroH2A1 εδράζεται στο χρωμόσωμα 13. Οι ιστόνες macroH2A1.2 και macroH2A2 εντοπίζονται σε υψηλή συγκέντρωση γύρω απ’ το χρωμόσωμα Χ, συμμετέχοντας στο μηχανισμό της εξάπλωσης της αδρανοποίησης, δρώντας με παρόμοιο τρόπο, όμως καμία εκ των δύο δε φαίνεται να λαμβάνει μέρος στο μηχανισμό για τη διατήρηση της αδρανοποίησης. Οι δύο αυτές ιστόνες, στον άνθρωπο, παρουσιάζουν 68% ομοιότητα όσον αφορά την αλληλουχία των αμινοξέων τους. Στο ποντίκι, η macroH2A2 εμφανίζει ένα πολύ διαφορετικό μοτίβο έκφρασης σε ορισμένες κυτταρικές σειρές, όπως αυτές που ανήκουν στο ήπαρ και στους νεφρούς.

Η αλυσίδα της macroH2A είναι μοναδική, καθώς αποτελείται από μια αμινοτελική περιοχή, η οποία σχεδόν ταυτίζεται με μια πλήρη ιστόνη Η2Α, ακολουθούμενη από μια μεγάλη “μη ιστονική” περιοχή. Επίσης, εμφανίζει χαρακτηριστική πυρηνική δομή, η οποία ονομάζεται “macrochromatin body” (MCB), καθώς και ιδιαίτερη δομή γύρω απ’ το κεντροσωμάτιο Σύνδεση της macroH2A στο κεντροσωμάτιο, κατά τη μετάφαση, εντοπίζεται σε όλα τα χρωμοσώματα, όσον αφορά τον άνθρωπο, η συγκέντρωση της όμως είναι σαφώς υψηλότερη στο κεντροσωμάτιο του αδρανοποιημένου χρωμοσώματος Χ. Επίσης, στον άνθρωπο και στο ποντίκι έχει παρατηρηθεί σύνδεση της macroH2A1 και σε άτομα ΧΧ, αλλά και σε άτομα ΧΥ. Ένα ακόμα ενδιαφέρον δεδομένο που προκύπτει από πρόσφατη έρευνα είναι ότι όταν δεν υπάρχει μεταγραφή του γονιδίου για το Xist RNA στο Χ χρωμόσωμα, δεν παρατηρείται η χαρακτηριστική πυρηνική δομή (MCB) της ιστόνης macroH2A1. Αυτό σημαίνει, όπως φαίνεται και στο επόμενο υποκεφάλαιο (“κυτταρικός κύκλος και Xist RNA”), πως έχουμε σχηματισμό του MCB κατά τη διάρκεια συγκεκριμένων κυτταρικών φάσεων κατά τις οποίες έχουμε και παρουσία του Xist RNA (ισχύει και για τον άνθρωπο και για το ποντίκι). Έτσι, το MCB αποτελεί χαρακτηριστικό της φάσης S, ενώ κατά το τέλος αυτής της φάσης “διασκορπίζεται” για ν’ αρχίσει να ανασχηματίζεται λίγο πριν την έναρξη της φάσης G1 του κυτταρικού κύκλου (εικόνα 2.2.5-πείραμα με κυτταρικές σειρές 46,ΧΧ ανθρώπου). Κατά τη διάρκεια της μίτωσης, παραμένει συνδεδεμένο με συγκεκριμένες περιοχές του ανενεργού Χ χρωμοσώματος, συμπεριλαμβανομένου και του Xic. Αυτή η σύνδεση περιλαμβάνει ένα “μοντέλο”, σύμφωνα με το οποίο η macroH2A1 σκεπάζει εν μέρει την ιστόνη Η3 στο σημείο όπου έχουμε μεθυλίωση στη λυσίνη 4 στην περιοχή DXZA στο Χq24.

Η συσσώρευση της macroH2A1 στο κεντροσωμάτιο γίνεται με την παρουσία ενός αναστολέα του πρωτεοσώματος 20S. Το φαινόμενο αυτό αποτελεί πιθανότατα μέρος ενός “μονοπατιού υποβιβασμού” (degradation pathway), μηχανισμού κοινού σε ένα πλήθος άλλων χρωματινικών πρωτεϊνών.

ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ & XIST RNA

Πριν προχωρήσουμε στην τρίτη φάση της αδρανοποίησης του χρωμοσώματος Χ, είναι πολύ ενδιαφέρον να παρακολουθήσουμε, σύντομα, πού εντοπίζεται το Xist RNA κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, δηλαδή, ουσιαστικά, κατά τη διάρκεια ποιών φάσεων του κυτταρικού κύκλου διατηρείται η αδρανοποίηση. Έτσι, μπορούμε να επιβεβαιώσουμε τα όσα ελέχθησαν στο προηγούμενο υποκεφάλαιο σχετικά με τη σύγχρονη εμφάνιση του MCB και του Xist RNA γύρω απ’ το χρωμόσωμα που υφίσταται την αδρανοποίηση. Στην εικόνα 2.2.6, έχουμε εικόνες από κύτταρα αρουραίου και συγκεκριμένα, του M.transcaspicus, από μελέτες που έγιναν απ’ τη Sarah M.Duthie και την επιστημονική ομάδα της (1999). Πρόκειται για DNA/RNA ανάλυση FISH. Το Xist RNA έχει σημανθεί με FITC (πράσινο χρώμα), ενώ μία συγκεκριμένη επαναλαμβανόμενη ετεροχρωματινική αλληλουχία DNA στο Χ χρωμόσωμα έχει σημανθεί με TR (κόκκινο χρώμα) . Στο εικονίδιο (a) το κύττα βρίσκεται στη μεσόφαση, στα εικονίδια (b)-(d) έχουμε την πρόφαση, τη μετάφαση και την ανάφαση αντίστοιχα, στο εικονίδιο (e) έχουμε την τελόφαση και τέλος, στο εικονίδιο (f) τα δύο νέα κύτταρα βρίσκονται και πάλι στη μεσόφαση, στην αρχή της φάσης G1 κυτταρικού τους κύκλου. Παρατηρούμε, λοιπόν, πως κατά τη διάρκεια της μεσόφασης, καθώς και κατά τη διάρκεια της πρόφασης, της μετάφασης και ως και την ανάφαση, το Xist RNA (πράσινη περιοχή) μεταγράφεται από το χρωμόσωμα Χ (ουσιαστικά είναι η κόκκινη περιοχή) που υφίσταται την αδρανοποίηση και συνδέεται σ’ αυτό. Όμως, στην τελόφαση, όπου πλέον έχουμε τα δύο θυγατρικά κύτταρα, το Xist RNA δεν είναι συνδεδεμένο με το ανενεργό Χ αλλά, εντοπίζεται ως διασκορπισμένα τμήματα στο επίπεδο της σχισμής μεταξύ των δύο νέων κυττάρων, δηλαδή η αδρανοποίηση δε διατηρείται στη φάση αυτή του κυτταρικού κύκλου. Τέλος, στην αρχή της φάσης G1, παρατηρείται μικρή πράσινη κουκίδα κοντά στο ένα απ’ τα δύο Χ χρωμοσώματα κάθε θυγατρικού κυττάρου, γεγονός το οποίο οδηγεί στην άποψη ότι το Xist RNA μεταγράφεται γρήγορα αμέσως μετά τη μίτωση από το χρωμόσωμα Χ που αδρανοποιείται.

Γ) ΤΡΙΤΗ ΦΑΣΗ: ΔΙΑΤΗΡΗΣΗ ΤΗΣ ΑΔΡΑΝΟΠΟΙΗΣΗΣ

Η διατήρηση της αδρανοποίησης κατά τη διάρκεια συγκεκριμένων σταδίων του κυτταρικού κύκλου, όπως είδαμε νωρίτερα, είναι απαραίτητη για τη φυσιολογική λειτουργία ενός κυττάρου ή ακόμα και για τη βιωσιμότητα του (αντιστάθμιση του γονιδιακού πλεονάσματος, κεφάλαιο πρώτο). Εάν οι παράγοντες που την εξασφαλίζουν για κάποιο λόγο απουσιάζουν ή δεν επιτελούν σωστά τη λειτουργία τους και παρά την ενδεχομένως φυσιολογικά πραγματοποιούμενη διαδικασία της έναρξης και της εξάπλωσης, το κύτταρο και κατ’ επέκταση και ο οργανισμός θα υποστούν τις συνέπειες της μερικής ή ολικής μη αδρανοποίησης του Χ χρωμοσώματος (νόσοι συνδεόμενοι με τέτοιες καταστάσεις, στον άνθρωπο, παρουσιάζονται στο αντίστοιχο κεφάλαιο).

ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΚΑΘΟΡΙΖΟΥΝ ΤΗ ΔΙΑΤΗΡΗΣΗ ΤΗΣ ΑΔΡΑΝΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΟΥ Χ ΧΡΩΜΟΣΩΜΑΤΟΣ

Η διατήρηση της αδρανοποίησης του χρωμοσώματος Χ, σύμφωνα με τα αποτελέσματα των πιο πρόσφατων μελετών, καθορίζεται κατά κύριο λόγο από το ΒΑΘΜΟ:

• ακετυλίωσης των ιστονών (Η2Α, Η3, Η4)
• μεθυλίωσης των C των νησιδίων CpG

Και:

• γονίδιο eed (ΜΟΝΟ στα ΠΟΝΤΙΚΙΑ)

ΑΚΕΤΥΛΙΩΣΗ

Η ακετυλίωση, γενικά, αποτελεί ρυθμιστικό μηχανισμό με τον οποίο το κύτταρο μπορεί να ελέγξει την αντιγραφή του DNA του, καθώς και ποικίλες άλλες διεργασίες στον πυρήνα. Για να ακετυλιωθεί μία περιοχή του μορίου του DNA (συνήθως αυτή η περιοχή είναι κοντά στον εκκινητή), απαιτείται η δημιουργία συμπλέγματος ορισμένων σε κάθε περίπτωση παραγόντων. Σ’ αυτούς τους παράγοντες συμπεριλαμβάνονται: διάφοροι μεταγραφικοί παράγοντες, πιθανότατα κάποιο μόριο που αναγνωρίζει τον εκκινητή και φυσικά η κατάλληλη ακετυλοτρανσφεράση, η οποία θα καταλύσει την αντίδραση της ακετυλίωσης της λυσίνης. Όλοι αυτοί οι παράγοντες, συγκεντρώνονται στην περιοχή γύρω απ’ τον εκκινητή και αλληλεπιδρώντας με την ακετυλοτρανσφεράση, οδηγούν στην ακετυλίωση των ιστονών.

Ο πολύ γενικός αυτός μηχανισμός, που μόλις αναλύθηκε, ισχύει σε όλα τα χρωμοσώματα, με τη συμμετοχή διαφορετικών ενδεχομένως κάθε φορά παραγόντων, καθώς και διαφορετικούς συνδυασμούς αυτών. Επίσης , πρέπει να αναφέρουμε ότι η ακετυλίωση θεωρείται ένας μηχανισμός η δράση του οποίου συμβάλλει στη μεταγραφή των γονιδίων, με τον εντοπισμό, βάσει των πιο πρόσφατων ερευνών, πολύ λίγων εξαιρέσεων σε αυτό τον κανόνα. Όσον αφορά την ιδιαίτερη περίπτωση του χρωμοσώματος Χ, όπως είπαμε και νωρίτερα, η ακετυλίωση συμβάλλει στην εξάπλωση, αλλά παίζει πολύ σημαντικό ρόλο και στη διατήρηση της αδρανοποίησης . Θα δούμε αμέσως παρακάτω το πώς σχετίζεται με την αδρανοποίηση, αναλύοντας ουσιαστικά την επίδρασή της στις ιστόνες κατ’ αρχάς και σε ολόκληρο το μόριο του DNA τελικά.

Από χημική άποψη, ακετυλίωση είναι, σε πολύ γενικές γραμμές, η αφαίρεση ενός μορίου υδρογόνου (Η2) και η προσθήκη μιας ακετυλομάδας (-COCH3) στη θέση αυτή. Παρατηρείται στις ιστόνες Η3 και Η4 κυρίως, καθώς και στην ιστόνη Η2Α (οι ιστόνες, ως γνωστόν, είναι πρωτεΐνες που συμμετέχουν στη δομή του νουκλεοσώματος). Πιο συγκεκριμένα, ακετυλίωση υφίσταται η λυσίνη του αμινοτελικού (Ν-τελικού) άκρου της αμινοξικής αλυσίδας των ιστονών (εικόνα 2.2.8). Πιθανότατα, η λυσίνη 9, 14 και 18 της αλυσίδας των αμινοξέων της ιστόνης Η3 και η λυσίνη 5 και 12 αυτής της ιστόνης Η4. Η ακετυλίωση αυτή οδηγεί, εκ των πραγμάτων, σε αφαίρεση του θετικού φορτίου της λυσίνης, άρα σε μείωση της συγγένειας DNA-ιστονών. Αυτό συμβαίνει διότι το φορτίο των ιστονών γίνεται πιο αρνητικό, το φορτίο που φέρει το μόριο του DNA είναι πάντοτε αρνητικό εξαιτίας των φωσφορικών ομάδων, άρα DNA και ιστόνες έλκονται λιγότερο ισχυρά. Συνεπώς, οι δομές των νουκλεοσωμάτων “χαλαρώνουν”, διευκολύνοντας την πρόσβαση της RNA πολυμεράσης και επιπλέον, των μεταγραφικών παραγόντων για τη μεταγραφή των γονιδίων του DNA. Άρα, η ακετυλίωση των ιστονών προκαλεί αύξηση της μεταγραφικής ικανότητας στο χρωμόσωμα. Στο ανενεργό χρωμόσωμα Χ έχει παρατηρηθεί υποακετυλίωση των ιστονών.

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ : Η υποακετυλίωση, δηλαδή ο μικρότερος βαθμός ακετυλίωσης από το συνήθη στα άλλα ενεργά χρωμοσώματα, εμποδίζει τη μεταγραφή του χρωμοσώματος Χ, συμβάλλοντας σημαντικά στη διατήρηση της αδρανοποίησης του

Στην εικόνα 2.2.8, βλέπουμε ότι η ακετυλίωση καταλύεται από τις ακετυλοτρανσφεράσες (HATs: histone acetyltransferases), ενώ η αντίθετη αντίδραση, η αποακετυλίωση, από τις αποακετυλάσες (HDs ή HDACs: histone deacetylases). Έχουν αναγνωριστεί διάφορα είδη HATs και HDs, ανάμεσά τους και οι CBP/p300, που είναι ίσως και τα πιο σημαντικά.

ΜΕΘΥΛΙΩΣΗ

Όσον αφορά τη μεθυλίωση, θα αναφερθούν, όπως είπαμε, μερικά στοιχεία για το ρόλο της στην αδρανοποίηση σ’ αυτή την παράγραφο, ενώ εκτενής ανάλυση θα υπάρξει στο ομώνυμο κεφάλαιο.

Μεθυλίωση συμβαίνει στις κυτοσίνες (C) του μορίου του DNA. Γενικά, παρατηρείται ο ίδιος βαθμός μεθυλίωσης στο αδρανοποιημένο και στο μη αδρανοποιημένο Χ χρωμόσωμα. Όμως, τα νησίδια CpG του ανενεργού Χ εμφανίζονται υπερμεθυλιωμένα, σε αντίθεση με τα νησίδια CpG που σχετίζονται με γονίδια που διαφεύγουν της αδρανοποίησης και δεν εμφανίζονται σε καμία περίπτωση υπερμεθυλιωμένα. Η παρατήρηση αυτή οδηγεί στο

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ : ότι η υπερμεθυλίωση των νησιδίων CpG, δηλαδή ο υψηλός βαθμός μεθυλίωσής τους, συμβάλλει στη διατήρηση της αδρανοποίησης.

ΓΟΝΙΔΙΟ eed

Το γονίδιο αυτό, το οποίο εντοπίζεται μόνο στα ποντίκια, είναι απαραίτητο για τη διατήρηση της αδρανοποίησης. Ανήκει στο “Polycomb group”, μία οικογένεια γονιδίων, στο ποντίκι, που ελέγχει τη γονιδιακή δραστηριότητα του κυττάρου κατά τη διάρκεια ανάπτυξης του. Σύμφωνα με μελέτες του Terry Magnuson και της ομάδας του στο πανεπιστήμιο της Νότιας Καρολίνας, στα ποντίκια που υπάρχει έλλειψη αυτού του γονιδίου, η αδρανοποίηση δε διατηρείται σε όλα τα γονίδια που φυσιολογικά πρέπει να είναι ανενεργά. Επίσης, συμπέραναν ότι το γονίδιο eed απαιτείται για τη διατήρηση της αδρανούς μορφής μετά την αρχική αδρανοποίηση απ’ το Xist.

Θηλυκά έμβρυα ποντικού, τα οποία έχουν ελαττωματικό, αλλά λειτουργικό γονίδιο eed, αναπτύσσονται μεν πλήρως, όμως, παρουσιάζουν, συχνά, διάφορα προβλήματα, όπως είναι το λέμφωμα. Το μόνο που είναι γνωστό είναι ότι το γονίδιο eed σχετίζεται με το πακετάρισμα του DNA στα χρωμοσώματα. Το πώς ακριβώς “φιμώνει” το χρωμόσωμα Χ, μένει να μελετηθεί, με βάση τα λεγόμενα του Magnuson.

ΕΞΑΙΡΕΣΕΙΣ ΣΤΗ ΔΙΑΤΗΡΗΣΗ ΤΗΣ ΑΔΡΑΝΟΠΟΙΗΣΗΣ

Κλείνοντας αυτό το κεφάλαιο, μπορούμε να αναφέρουμε ενδεικτικά ορισμένες εξαιρέσεις, γενικότερα, σχετικά με τη διατήρηση της αδρανοποίησης.

IN VIVO

Σε ζώντες οργανισμούς συμβαίνει επανενεργοποίηση του αδρανοποιημένου χρωμοσώματος Χ σε δύο περιπτώσεις:

• στα θηλυκά γεννητικά κύτταρα κατά τη διάρκεια της μείωσης
• σε ορισμένα γονίδια ηλικιωμένων ζώων

Στα τελευταία, έχει παρατηρηθεί σταδιακή άρση της αδρανοποίησης ορισμένων μόνο γονιδίων τους. Συγκεκριμένα, στο ποντίκι, έχει εμφανιστεί επανενεργοποίηση των γονιδίων OTC (ornithine transcarbamylase) και Atp7a ( περιοχή Mottled, σχετίζεται με το χρώμα του τριχώματος), το οποίο βρίσκεται κοντά στο κέντρο αδρανοποίησης του χρωμοσώματος Χ (Xic). Όμως, άρση της αδρανοποίησης σχετιζόμενη με την ηλικία δεν έχει παρατηρηθεί σε άλλες περιοχές του χρωμοσώματος Χ, όπως παραδείγματος χάριν η περιοχή Tabby στο ποντίκι ή η περιοχή Hprt στον άνθρωπο ή στο ποντίκι. Η περιοχή Tabby βρίσκεται κοντά στο κέντρο αδρανοποίησης, όπως και η Mottled, γεγονός το οποίο φανερώνει πως οι διαφορές μεταξύ γονιδίων είναι απίθανο να συνδέονται μόνο με την απόσταση αυτών από το κέντρο αδρανοποίησης. Επιπλέον, οι γενικότερες παρατηρήσεις είναι συμβατές με την ιδέα εγγενών διαφορών σχετικών με τη χρονική σταθερότητα των γονιδίων αυτών του ποντικιού στην αδρανοποίηση. Τέλος, πολύ ενδιαφέρον είναι το ότι επανενεργοποίηση γονιδίων ηλικιωμένων οργανισμών δεν παρατηρείται μόνο σε ενδογενή γονίδια του χρωμοσώματος Χ, αλλά και σε αυτοσωμικά γονίδια, τα οποία έχουν παρεμβληθεί ανάμεσα στα πρώτα.

ΕΛΕΥΘΕΡΟ ΑΝΑΓΝΩΣΜΑ 1 - Η ΠΙΘΑΝΗ ΚΑΡΚΙΝΟΓΕΝΕΣΗ ΑΠΟ ΤΗ ΔΡΑΣΗ ΤΗΣ 5-ΑΖΩΤΟ-ΚΥΤΙΔΙΝΗΣ

Σ’ αυτό το ελεύθερο ανάγνωσμα, θα παρουσιαστεί ένα απ’ τα πειράματα που έχουν γίνει τα τελευταία χρόνια (CAS, No.320-67-2), το οποίο είχε σκοπό να καταδείξει εάν οι υποθέσεις για πρόκληση όγκων (καρκινογένεση), εξαιτίας της δράσης της 5-άζωτο-κυτιδίνης ισχύουν πραγματικά. Η τυχόν επιβεβαίωση μιας τέτοιας υπόθεσης, θα είχε πολύ μεγάλο ενδιαφέρον για την κλινική πράξη και αξίζει να προσεχθεί η κάθε προσπάθεια έρευνας σ’ αυτό τον τομέα.

Για την πραγματοποίηση του πειράματος χρησιμοποιήθηκαν δύο ομάδες των 35 αρουραίων Sprague-Dawley, μία από κάθε φύλο, καθώς και δύο ομάδες των 35 ποντικιών B6C3F1, επίσης μία από κάθε φύλο. Σ’ αυτά τα πειραματόζωα χορηγήθηκε με διαπεριτοναϊκή ένεση 5-άζωτο-κυτιδίνης σε διαφορετικές δόσεις και για διαφορετικό χρονικό διάστημα. Πιο συγκεκριμένα, στους αρουραίους χορηγήθηκε μία εκ των δύο δόσεων: είτε 2,6 είτε 5,2 mg/kg σωματικού βάρους από την ουσία (5-αζωτο-κυτιδίνη) διαλυμένη σε ρυθμιστικό διάλυμα αλάτων, τρεις φορές την εβδομάδα και για χρονικό διάστημα 34 εβδομάδων. Μετά το πέρας της χορήγησης της ουσίας, παρακολουθήθηκε η πορεία των αρουραίων για 46-47 εβδομάδες. Επίσης, υπήρξαν και δύο ομάδες των 15 αρουραίων από κάθε φύλο, οι οποίοι αποτέλεσαν τους μάρτυρες. Αυτοί, είτε δέχθηκαν ενέσεις ρυθμιστικού διαλύματος, είτε δε δέχθηκαν καθόλου ενέσεις. Όλοι οι αρουραίοι που επέζησαν, σκοτώθηκαν στις 80-81 εβδομάδες απ’ την έναρξη του πειράματος. Στα ποντίκια χορηγήθηκε μία εκ των δύο δόσεων: : είτε 2,2 είτε 4,4 mg/kg σωματικού βάρους από την ουσία (5-αζωτο-κυτιδίνη) διαλυμένη σε ρυθμιστικό διάλυμα αλάτων, τρεις φορές την εβδομάδα και για χρονικό διάστημα 52 εβδομάδων. Μετά το πέρας της χορήγησης της ουσίας, παρακολουθήθηκε η πορεία των ποντικιών για 29-30 εβδομάδες. Ακόμα, υπήρξαν και εδώ δύο ομάδες των 15 ποντικιών από κάθε φύλο, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες και είτε δέχθηκαν ενέσεις ρυθμιστικού διαλύματος, είτε δε δέχθηκαν καθόλου ενέσεις, όπως έγινε και με τους αρουραίους. Όλα όσα επιβίωσαν, σκοτώθηκαν στις 81-82 εβδομάδες.

Τα συμπεράσματα που βγήκαν με βάση την ανάλυση των αποτελεσμάτων του πειράματος αυτού δεν οδηγούν, όπως θα δούμε αμέσως παρακάτω, σε επιβεβαίωση της καρκινογόνου δράσης της 5-άζωτο-κυτιδίνης, αλλά την εμφανίζουν ως πιθανή. Η 5-άζωτο-κυτιδίνη αποδείχθηκε τοξική, αφού το κατά μέσο όρο σωματικό βάρος και για τους αρουραίους και για τα ποντίκια που δέχθηκαν χορήγηση της ουσίας, ήταν χαμηλότερο από το αντίστοιχο των μαρτύρων. Στην εξαγωγή αυτού του συμπεράσματος συνέβαλε και το γεγονός ότι κανένα απ’ τα πειραματόζωα που δέχθηκαν μεγάλη δόση (αρουραίοι και των δύο φύλων, θηλυκά ποντίκια) δεν έζησαν ως το τέλος της έρευνας. Γενικά, στους αρσενικούς και θηλυκούς αρουραίους και στα αρσενικά ποντίκια, η επιβίωση ήταν ανεπαρκής για να γίνει στατιστική ανάλυση των περιπτώσεων καρκίνων. Μόνο ένας αρσενικός και τρεις θηλυκοί αρουραίοι, οι οποίοι δέχθηκαν μεγάλη δόση, εμφάνισαν όγκους, ενώ σε καμία ομάδα πειραματόζωων από αυτά τα οποία δέχθηκαν χαμηλή δόση της ουσίας δεν αποδείχθηκε με τη χρήση στατιστικών τεστ αυξημένη συχνότητα εμφάνισης καρκίνου. Όσον αφορά τα θηλυκά ποντίκια, τα οποία δέχθηκαν υψηλή δόση της 5-άζωτο-κυτιδίνης, εμφάνισαν ένα είδος ατροφίας των οστών (bone-marrow), οφειλόμενο σε όγκους στο αιμοποιητικό σύστημα αυτών.

Οι επιστήμονες, οι οποίοι πραγματοποίησαν το πείραμα, κατέληξαν ότι οι συνθήκες κάτω απ’ τις οποίες έγινε η μελέτη, καθώς και το μικρό διάστημα χορήγησης της ουσίας και φυσικά, ζωής των πειραματόζωων, τους εμπόδισαν να εκτιμήσουν την καρκινογόνο δράση της 5-άζωτο-κυτιδίνης. Παρ’ όλα αυτά, η επαγωγή όγκων στο αιμοποιητικό σύστημα των οστών των θηλυκών ποντικών, σχετίστηκε με τη χορήγηση της 5-άζωτο-κυτιδίνης.

IN VITRO

Στο εργαστήριο, επανενεργοποίηση, έστω και μερική, επιτυγχάνεται με δύο κυρίως τρόπους:

• με την 5-άζωτο-κυτιδίνη (5-azacytidine) (C8H12N4O5) (εικόνα 2.2.11), ουσία η οποία οδηγεί σε μερική απομεθυλίωση των νησιδίων CpG, άρα και σε μερική άρση της αδρανοποίησης
• με την trichostatin A, (εικόνα 2.2.12) ουσία η οποία αποτελεί παράγοντα ακετυλίωσης, δρώντας ως αναστολέας της αποακετυλάσης

Η 5-άζωτο-κυτιδίνη (5-azacytidine) αποτελεί συνθετικό ανάλογο της κυτιδίνης και έχει χρησιμοποιηθεί πειραματικά στο παρελθόν (ΗΠΑ 1970) ως αντικαρκινικό φάρμακο. Αντικαρκινική δράση πιθανολογείται πως έχει και η trichostatin A. Όμως, τα τελευταία χρόνια, πειράματα έχουν δείξει πως η δράση της 5-άζωτο-κυτιδίνης είναι πιθανότατα αντίθετη απ’ αυτή που αρχικά είχε υποτεθεί, δηλαδή ενοχοποιείται πλέον για πιθανή καρκινογένεση (βλέπε ελεύθερο ανάγνωσμα).

ΕΛΕΥΘΕΡΟ ΑΝΑΓΝΩΣΜΑ 2 - Εντοπισμός του Xist RNA στην περίπτωση μετάθεσης Χ/αυτοσώματος

Είναι ιδιαίτερα ενδιαφέρον να δούμε τα αποτελέσματα μελέτης επιστημόνων σχετικά με το πώς και κατά πόσο εξαπλώνεται η αδρανοποίηση σ’ ένα Χ χρωμόσωμα το οποίο έχει δεχθεί τμήμα από κάποιο αυτοσωμικό χρωμόσωμα. Στο πείραμα, που παρουσιάζεται συνοπτικά παρακάτω, έχουμε την ενσωμάτωση μιας περιοχής του χρωμοσώματος 7 αρουραίου στο χρωμόσωμα Χ, η οποία συντομογραφικά συμβολίζεται Is1CtX .

Η υποακετυλίωση της ιστόνης Η4, όπως έχει ήδη αναλυθεί, σχετίζεται με την “παρεμπόδιση” της μεταγραφής, γι’ αυτό το λόγο επιλέχθηκε ως ένας έμμεσος τρόπος μαρκαρίσματος για την εξάπλωση της αδρανοποίησης. Το ανενεργό Χ χρωμόσωμα εμφανίζεται, γενικά, όχι πολύ έντονα χρωματισμένο . Όμως , οι ακετυλιωμένες περιοχές εμφανίζονται πιο έντονες, οι οποίες εν προκειμένω είναι η ψευδοαυτοσωμική περιοχή PAR2 και μία ακόμη περιοχή κοντά σε αυτή. Με διάφορους πειραματισμούς και σημάνσεις (με D7HD12, SnrpN και άλλα μέσα) (a) επιβεβαιώθηκε ότι η δεύτερη αυτή περιοχή ανήκε στο χρωμόσωμα 7 (d). Σύμφωνα με τα στατιστικά αποτελέσματα της μελέτης, το 93% των τμημάτων του αυτοσωμικού χρωμοσώματος εντοπίστηκαν υπερακετυλιωμένα. Σε ένα 5% των χρωμοσωμάτων, η υπερακετυλιωμένη περιοχή στο Is1CtX εμφανίστηκε να εκτείνεται από την ενσωματωμένη περιοχή μέχρι το τελομερίδιο, χωρίς διακοπή. Αυτό το γεγονός, κατά τους ερευνητές, οφείλεται είτε στο ότι η συμπύκνωση της χρωματίνης “έκρυψε” το υποακετυλιωμένο τμήμα του χρωμοσώματος Χ, είτε ενδεχομένως στο ότι η ενσωμάτωση του αυτοσωμικού τμήματος χρωματίνης μπλόκαρε την εξάπλωση του σήματος αδρανοποίησης στη συγκεκριμένη περιοχή. Τέλος, σε ένα 2%, το Is1CtX ήταν πλήρως υποακετυλιωμένο. Αυτό το τελευταίο αποτέλεσμα πιθανότατα οφείλεται σε τεχνικούς παράγοντες, όπως στην ποιότητα της εξάπλωσης, η οποία βρέθηκε να ποικίλλει στα διάφορα τμήματα ή στο ότι ο μηχανισμός της αδρανοποίησης έδρασε αποτελεσματικά και στα αυτοσωμικά τμήματα (h).

Για να εξακριβώσουν οι ερευνητές εάν η εντόπιση του Xist RNA αντιστοιχεί στις παρατηρούμενες υποακετυλιωμένες περιοχές, χρησιμοποίησαν την τεχνική DNA/RNA FISH, ώστε να συγκρίνουν τη θέση του με αυτή των περιοχών D7HD12 και SnrpN (e)-(g). Τα αποτελέσματα ήταν επίσης θεαματικά. Μικρή ή καθόλου εξάπλωση του σήματος του Xist RNA στο ενσωματωμένο αυτοσωμικό υλικό παρατηρήθηκε στο 68% των Is1CtX χρωμοσωμάτων (e). Σ’ ένα 28% των χρωμοσωμάτων, το σήμα του Xist RNA ταίριαζε με ένα τουλάχιστον εκ των δύο σημάτων δεικτών του DNA (D7HD12, SnrpN), δείχνοντας ότι το Xist RNA είχε εξαπλωθεί μόνο σ’ αυτές τις περιοχές(f). Τέλος, σ’ ένα 4% των μεταφάσεων , παρατηρήθηκαν αραιά σήματα Xist RNA, διασκορπισμένα σε όλη την έκταση της ενσωματωμένης στο Χ χρωμόσωμα περιοχής.

Επομένως, με βάση τα νέα στοιχεία που προέκυψαν απ’ αυτή τη μελέτη, το Xist RNA φαίνεται πως συνδέεται πιο αποτελεσματικά με το Χ χρωμόσωμα παρά με τις ενσωματωμένες αυτοσωμικές περιοχές, συμπίπτοντας με τις υποακετυλιωμένες περιοχές.

ΠΡΟΟΠΤΙΚΗ ΓΙΑ ΤΟ ΜΕΛΛΟΝ

Τις τελευταίες δεκαετίες, η αδρανοποίηση του χρωμοσώματος Χ ως φαινόμενο και οι μηχανισμοί αυτής αποτελούν αντικείμενο έρευνας, το οποίο έχει προσελκύσει πολλούς επιστήμονες, από κάθε γωνιά της γης. Τα δεδομένα των διαφόρων ερευνών ολοένα και αποκαλύπτουν νέες πτυχές του φαινομένου, όμως, μένουν ακόμα πολλά ερωτήματα αναπάντητα. Ποιος είναι ο ακριβής μηχανισμός που συγκρατεί το Xist RNA γύρω απ’ το Χ χρωμόσωμα; Ποια είναι η φύση του σήματος που προκαλεί την έναρξη της αδρανοποίησης; Ποια η λειτουργία του γονιδίου eed; Ποιοι παράγοντες καθορίζουν ποιο γονίδιο θα επανενεργοποιηθεί (ηλικιωμένα ζώα); Ισχύουν όλα αυτά για τον άνθρωπο και αν όχι, τι ακριβώς ισχύει; Αυτά είναι μερικά μόνο απ’ τα ερωτήματα, των οποίων αναζητείται η απάντηση.

1. Πειραματική Εμβρυολογία , Ρ. Αγγελοπούλου
2. The William Allan Memorial Award Adress:X-chromosome inactivation and the location of expression of X-linked genes, Am.J.Hum.Genet. 42:008-016, 1988 (Mary F.Lyon)
3. Xist RNA exhibits a banded localization on the inactive X-chromosome and is excluded from autosomal material in cis, Human Molecular Genetics, 1999, Vol.8 No.2
4. Concepts of Genetics, 5th Edition, 1997, William S.Klug, Michael R.Cummings
5. Histone acetylation beyond promoters: long-range acetylation patterns in chromatin world, BioEssays 23:820-830, 2001
6. X-chromosome inactivation in mammals, Annu.Rev.Genet. 1997, 31:571-610, Edith Heard, Philippe Clerc, Philip Avner
7. X-inactivation by cromosomal pairing, Genes & Development, Vol.13, No18, pp.2339-2352, September 15, 1999, York Marahrens
8. Principles of development, Part I, Developmental Biology, 6th Edition, 2000, Scott F:Gilbert
9. Regulation of X-chromosome inactivation in development in mice and humans, Microbiol Mol.Biol.Rev., June 1998, p.362-378, Vol.62, No.2
10. Assessment of mechanism of acquired skewed X-inactivation, Blood, 1 March 2001, Vol.97, No.5, pp.1274-1281
11. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, August 28, 2001,Vol.98, No.18, pp.10232-10237
12. X-chromosome inactivation in mammals, Cell, Vol. 29, p.721-724, July 1982, Gail R.Martin
13. The human X-inactivation centre is not required for maintenance of X-chromosome inactivation, Nature, March 10, 1994, 368(6467): 154-6, Brown CJ, Willard HF (abstract)
14. Cell cycle-dependant localization of macroH2A in chromatin of the inactive X- chromosome, The Journal of Cell Biology, volume 157, number 7, p.1113-1123
15. MacroH2A2, a new member of the MacroH2A core histone family, J.Biol.Chem. , June 15, 2001, vol. 276, Issue 24, p.211776-211784, Carl Constanzi, John R.Pehrson
16. Some milestones in the history of X-chromosome inactivation, Annu.Rev.Genet., 1992: 26, p.17-28, Mary F.Lyon

Εργασία που παρουσιάστηκε από τη φοιτήτρια Ιατρικής Φεβράνογλου Χριστίνα
στα πλαίσια του κατ'επιλογήν μαθήματος της Πειραματικής Εμβρυολογίας
Υπεύθυνη μαθήματος : Ρωξάνη Αγγελοπούλου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια
Εργαστήριο Ιστολογίας και Εμβρυολογίας
Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών
Για περισσότερες πληροφορίες μπορείτε να ανατρέξετε στον ιστότοπο του μαθήματος της Πειραματικής Εμβρυολογίας: http://www.med.uoa.gr/expembr/
Τελευταία αναθεώρηση : 1/5/2006