2.3 ΒΙΟΧΗΜΙΚΗ ΔΙΑΣΤΑΣΗ ΤΗΣ ΑΔΡΑΝΟΠΟΙΗΣΗΣ ΜΕΘΥΛΙΩΣΗ ΤΟΥ DNA

Μεθυλίωση

Εισαγωγή - Γενικά περί μεθυλίωσης

Η μεθυλίωση είναι μια διαδικασία καθοριστικής σημασίας που λαμβάνει χώρα στα κύτταρα. Τεράστια σπουδαιότητα έχει ιδιαίτερα η μεθυλίωση του DNA των κυττάρων που συμβαίνει σε συγκεκριμένες θέσεις του.

Όπως είναι γνωστό , κάθε κύτταρο του σώματος μας περιέχει δύο αντίγραφα για κάθε γονίδιό του ,εκ των οποίων , το ένα προέρχεται από τη μητέρα μας , ενώ το άλλο από τον πατέρα μας . Όμως δεν είναι απαραίτητο όλα τα δύο γονίδια σε ένα κύτταρο να εκφράζονται ,μάλιστα συγκεκριμένα μόνο γονίδια εκφράζονται σε κάθε κυτταρικό τύπο .Για παράδειγμα τα κύτταρα του ανθρώπινου εγκεφάλου δεν χρειάζεται να παράγουν αιμοσφαιρίνη ( μια πρωτεΐνη απαραίτητη για τη μεταφορά του οξυγόνου στο αίμα μας ) .Μόνο όσα από τα κύτταρα που θα εξελιχθούν σε τελικά ερυθροκύτταρα πρέπει να παράγουν την πρωτεΐνη αυτή . Και πράγματι , αν και τα κύτταρα του εγκεφάλου περιέχουν δύο ακέραια αντίγραφα του γονιδίου για την παραγωγή αιμοσφαιρίνης εντούτοις τα επίπεδα του RNA της αιμοσφαιρίνης είναι τουλάχιστον χίλιες φορές χαμηλότερα από τα αντίστοιχα επίπεδα που παρατηρούνται στα κύτταρα που θα εξελιχθούν έπειτα σε ερυθροκύτταρα του αίματος Άρα , πρέπει να υπάρχουν μηχανισμοί που ελέγχουν ποιο γονίδιο δραστηριοποιείται ή εκφράζεται , σε κάθε τύπο κυττάρων .Αυτοί οι μηχανισμοί ελέγχου είναι κυρίως και αυτοί που καθορίζουν και σε ποιόν κυτταρικό τύπο ανήκει το κάθε κύτταρο αν δηλαδή πρόκειται για ερυθροκύτταρο , εγκεφαλικό κύτταρο , μυϊκό ,ή για κύτταρο του δέρματος κ.λ.π . Για την ρύθμιση του βαθμού στον οποίο θα πρέπει κάθε γονίδιο να εκφράζεται υπάρχουν αρκετές σύνθετες πρωτεΐνες ( γνωστές και γενικότερα με τον όρο ρυθμιστικές πρωτεΐνες) οι οποίες προσδένονται σε συγκεκριμένα τμήματα του DNA ενεργοποιώντας ή αντίθετα αναστέλλοντας την έκφραση του κάθε γονιδίου .Σε κάθε πολύπλοκο οργανισμό , όπως είναι και ο ανθρώπινος πολλοί παράγοντες ελέγχου πρέπει να δρουν μαζί και ταυτόχρονα ώστε να επιτευχθούν τα σωστά επίπεδα ρύθμισης που απαιτούνται για τα συγκεκριμένα γονίδια . Ένας από τους τρόπους ελέγχου της ρύθμισης αυτής σχετίζεται με την προσθήκη μεθυλομάδων στην κυτοσίνη του DNA , οι οποίες λειτουργούν ως ένα είδος επισήμανσης του DNA στις θέσεις αυτές .

Ορισμός μεθυλίωσης : Με τον όρο μεθυλίωση εννοούμε την ομοιοπολική προσθήκη μεθυλομάδων (-CH3) στο DNA. (εικόνα 2.3.1.)

Συνήθως στα ευκαρυωτικά κύτταρα αφορά τη μεθυλίωση της κυτοσίνης και συσχετίζεται με ελαττωμένα επίπεδα μεταγραφής ενός γονιδίου. (εικόνα 2.3.2.)

Μεθυλίωση στα βακτήρια

Οργανισμοί που δεν είναι και τόσο σύνθετοι , όπως είναι άλλωστε αρκετοί τύποι βακτηρίων , συνήθως δεν χρησιμοποιούν τη διαδικασία της μεθυλίωσης της κυτοσίνης του DNA τους για να ρυθμίσουν τη δραστικότητα των γονιδίων τους . Ορισμένα βακτήρια , όχι όμως όλα , μεθυλιώνουν την αδενίνη του DNA τους για τον σκοπό αυτό .Εντούτοις , στα περισσότερα βακτήρια η μεθυλίωση του DNA αφορά τη διάκριση του αντιγραφόμενου από το μη αντιγραφόμενο κλώνο DNA . Επίσης σχετίζεται με την αναγνώριση των έμφυτων βακτηριακών χαρακτηριστικών στο DNA τους , παρέχοντας με τον τρόπο αυτό τη δυνατότητα να ξεχωρίζουν και να προστατεύουν το δικό τους γενετικό υλικό από αυτό των άλλων κυττάρων και των ιών , ώστε να μπορούν να καταστρέψουν το ‘ ξένο ’ DNA το οποίο εντοπίζεται στο εσωτερικό τους , με τη δράση των ενδονουκλεασών που τα ίδια παράγουν , δίχως όμως να καταστρέφουν μαζί με το ‘ ξένο ’ DNA και το δικό τους και δίχως ,έτσι να αλλοιώνουν τις γενετικές τους πληροφορίες που αυτό φέρει κωδικοποιημένες .

Μεθυλίωση στους ευκαρυώτες

Στους ευκαρυώτες η κυρίως γνωστή λειτουργία της μεθυλίωσης του DNA σχετίζεται με τον έλεγχο της αντιγραφής και με τη σχέση που φαίνεται πως υπάρχει ανάμεσα στην αδρανοποίηση ή μη των γονιδίων και στη διαδικασία της γενετικής αποτύπωσης μιας και στα δυο αυτά φαινόμενα διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο . Ακόμη , αφορά τη διατήρηση και σταθεροποίηση της αδρανοποίησης ( όπως γίνεται ιδιαίτερα αντιληπτό στην περίπτωση του Χ χρωμοσώματος ) , επιπλέον σχετίζεται με την εμβρυϊκή ανάπτυξη και ιστική εξειδίκευση , στην έκφραση διαφόρων γονιδίων σε κάθε τύπο κυττάρων και επιπρόσθετα με την υπερμεθυλίωση του DNA σχετίζεται και η διαδικασία της ογκογένεσης . Αν και τα γεγονότα στοιχειοθετούν πως υπάρχει μια αδιαμφισβήτητη σχέση μεταξύ της μεθυλίωσης του DNA και των διαδικασιών της εξάπλωσης , της αποτύπωσης ,της σταθεροποίησης , της δραστικότητας των γονιδίων και άλλων φαινομένων , εντούτοις , δεν έχει πλήρως διευκρινιστεί ο ρόλος της σε όλες τις πτυχές αυτών των φαινομένων μιας και πολλά σημεία της όλης διαδικασίας παραμένουν συγκεχυμένα . Αναφορικά , με ορισμένα από τα αναπάντητα ερωτήματα που υφίστανται ακόμη και εξακολουθούν να ταλανίζουν την επιστημονική κοινότητα για τη μεθυλίωση μπορούν να αναφερθούν τα ακόλουθα παράδοξα γεγονότα : Το πρότυπο της μεθυλίωσης σε συγκεκριμένες αλληλουχίες των γονιδίων στην ενεργή ή αδρανοποιημένη μορφή των Χ χρωμοσωμάτων είναι διαφορετικό όπως διαφορετικός είναι και ο τρόπος με τον οποίο αντιδρούν τα κύτταρα παρουσία της 5-azacytidine ( με μοριακό τύπο : C8H12N4O5 ) η οποία μπορεί να οδηγήσει σε μερική αναστρέψιμη αναστολή της καταστολής του ανενεργού Χ χρωμοσώματος ( παρακάτω θα γίνει ιδιαίτερη αναφορά στην 5-azacytidine ) . Εντούτοις , οι επιδράσεις και τα αποτελέσματα της μεθυλίωσης είναι προφανώς αρκετά σύνθετα και αυτό συνάγεται από το παράδειγμα : ότι η 5-azacytidine δεν οδηγεί σε πλήρη ενεργοποίηση του ανενεργού Χ χρωμοσώματος και επιπλέον επειδή το συγκεκριμένο πρότυπο μεθυλίωσης του ανενεργού Χ χρωμοσώματος περιλαμβάνει και την υπομεθυλίωση ορισμένων περιοχών όπως επίσης και τη μεθυλίωση κάποιων άλλων .

Μεθυλίωση - Αντιγραφή DNA - Αλληλουχίες CpG

Σχετικά με την παρουσία της μεθυλίωσης παρατηρείται πως το 2-7 % από τις κυτοσίνες ενός ζωικού κυττάρου είναι μεθυλιωμένες ποσοστό που ποικίλλει ανάλογα με το είδος , για παράδειγμα στον άνθρωπο μόνο το 3 % των κυτοσινών είναι μεθυλιωμένο . Τα περισσότερα από τα μεθυλιωμένα τμήματα συναντώνται σε νησίδες δινουκλεοτιδίων CpG ( κυτοσίνη :C ενωμένη με φωσφοδιεστερικό δεσμό 3’-5’ με την γουανίνη: G ) μήκους περίπου 1-2 kb. Οι αλληλουχίες CpG περιέχουν υψηλότερο ποσοστό κυτοσινών και γουανινών από το μέσο όρο , ενώ το DNA συναντάται κυρίως με τη δομή της ετεροχρωματίνης

Από μια άλλη οπτική γωνία η μεθυλίωση και η συμπύκνωση του DNA:

Η πλειοψηφία , μάλιστα ,των αλληλουχιών CpG , είναι μεθυλιωμένες . συγκεκριμένα η μισή σχεδόν ποσότητα των νησίδων CpG που περιέχει το DNA συναντάται σε μεθυλιωμένη μορφή .Συχνά εντοπίζονται στο 5’ άκρο του υποκινητή . Μεθυλιωμένες νησίδες CpG που συναντώνται στο αδρανές Χ χρωμόσωμα είναι οι11 από τις 13 στο ποντίκι και οι 28 από τις 28 που παρατηρούνται στο Χ χρωμόσωμα του ανθρώπου . Αντιθέτως στο ενεργό Χ χρωμόσωμα οι αντίστοιχες αυτές περιοχές , παρατηρείται πως είναι μη μεθυλιωμένες και έτσι , τα γονίδια που διαφεύγουν από την αδρανοποίηση του χρωμοσώματος Χ παραμένουν μη μεθυλιωμένα στο ενεργό και μη Χ χρωμόσωμα .

Συνήθως και οι δύο κυτοσίνες στις δύο αλυσίδες του DNA αυτής της παλινδρομικής αυτής αλληλουχίας είναι μεθυλιωμένες (για τη μεθυλιωμένη κυτοσίνη χρησιμοποιείται ο εξής συμβολισμός : mC ) .

Έτσι προκύπτει το ακόλουθο σχήμα - πρότυπο του DNA που δείχνει συνοπτικά και σε γενικές γραμμές τι ακριβώς συμβαίνει κατά τη διάρκεια της διαδικασίας της αντιγραφής του , όταν αυτό συναντάται με τη μεθυλιωμένη του μορφή ή όταν αυτό πρόκειται να υποστεί μεθυλίωση . Συγκεκριμένα έχουμε :

DNA:

• 5’- CpG- 3’
• 3’- GpC -5’

Με de novo μεθυλίωση με την DNMT 3a και DNMT 3b DNA μέθυλο τρανσφεράσες,

• 5’- mCpG- 3’
• 3’- GpC- 5’

και με διατήρηση μεθυλίωσης με την DNMT 1 DNA μέθυλο-τρανσφεράση, προκύπτει τελικά :

• 5’- mCpG- 3’
• 3’- GpCm -5’

Όπου το :

• 5’- mCpG- 3’
• 3’- GpCm -5’

τμήμα , αποτελεί και τη δομή κατά την οποία το DNA εμφανίζεται με την πλήρως μεθυλιωμένη μορφή του .

Εάν σε ένα τέτοιο τμήμα του DNA, (που όπως αναφέραμε περιγράφεται ως πλήρως μεθυλιωμένο ) , πραγματοποιηθεί διπλασιασμός της αλληλουχίας αυτού , τότε προκύπτουν δύο νέοι κλώνοι DNA . Καθένα από τα δύο αυτά ‘ νέα ’ δίκλωνα μόρια DNA περιέχει στον ένα κλώνο του μια μεθυλομάδα ενώ , το αντίστοιχο τμήμα του στον άλλο κλώνο του είναι μη μεθυλιωμένο . Το DNA αυτής της μορφής ονομάζεται ημιμεθυλιωμένο και προκύπτει κατά το ακόλουθο σχήμα :

• 5’- mCpG- 3’
• 3’- GpCm -5’

Με αντιγραφή του DNA, προκύπτουν δύο όμοιοι κλώνοι DNA της μορφής :

• 5’- mCpG- 3’
• 3’- GpC- 5’

Η σταθεροποίηση τώρα της μεθυλιωμένης περιοχής εξαρτάται από το τι συμβαίνει στο ημιμεθυλιωμένο τμήμα του DNA .

α) Εάν συμβεί μεθυλίωση στον μη μεθυλιωμένο κλώνο του DNA τότε το τμήμα αυτό που προκύπτει οδηγεί στην πλήρως μεθυλιωμένη κατάστασή του :

• 5’- mCpG- 3’
• 3’- GpC- 5’

αν συμβεί ξανά μεθυλίωση (αναγνώριση του ημιμεθυλιωμένου τμήματος DNA γίνεται με την DNMT 1 DNA μέθυλο τρανσφεράση), προκύπτει πάλι η πλήρως μεθυλιωμένη κατάσταση ( fully methylated )

• 5’- mCpG- 3’
• 3’- GpCm –5’

β) Εντούτοις , εάν μετά συμβεί ξανά αντιγραφή , η ημιμεθυλιωμένη κατάστασή του θα διαιωνιστεί στο ένα από τα δύο νέα τμήματα του DNA που θα προκύψουν ενώ αντίθετα , το άλλο τμήμα του DNA θα είναι πλήρως μη μεθυλιωμένο .

Άρα αν από το :

• 5’- mCpG- 3’
• 3’- GpC- 5’

συμβεί ξανά αντιγραφή, προκύπτουν δύο δίκλωνα τμήματα DNA, εκ των οποίων , το ένα τμήμα που προκύπτει είναι ημιμεθυλιωμένο ( hemimethylated ) , της μορφής :

• 5’- mCpG- 3’
• 3’- GpC- 5’

ενώ , το άλλο είναι μη μεθυλιωμένο ( unmethylated ) και είναι της μορφής :

• 5’- CpG- 3’
• 3’- GpC- 5’

Συνοπτικά προκύπτει το ακόλουθο σχήμα

Μεθυλίωση - Έκφραση γονιδίων - Δομή και βαθμός πτύχωσης της χρωματίνης

Τεράστιο ενδιαφέρον παρουσιάζει ο τρόπος με τον οποίο το γονιδίωμα των ευκαρυωτών είναι δομημένο , πώς λειτουργεί καθώς και πώς αυτό αλλάζει. Ιδιαίτερη προσοχή έχει δοθεί στην αδρανοποίηση των γονιδίων στους ευκαρύωτες και κυρίως στους μηχανισμούς που εμπλέκονται στη μεθυλίωση και στο να λάβει η χρωματίνη διαφορετικό βαθμό συμπύκνωσης σε συγκεκριμένες καταστάσεις . Είναι γνωστό , ότι η μεθυλίωση μεταβάλλει ιδιαίτερα χαρακτηριστικά του DNA , επηρεάζει την αλληλεπίδραση του DNA με τις πρωτεΐνες , την καταστολή των γονιδίων στα ζώα , φυτά και τους μύκητες καθώς και ότι είναι βασικός παράγοντας για την φυσιολογική ανάπτυξη σε ζώα και θηλαστικά .Μεθυλομάδες που λειτουργούν ως ενδείξεις - σημάδια στο DNA των ανθρώπων καθώς και άλλων θηλαστικών διαδραματίζουν ουσιαστικό ρόλο στον καθορισμό πότε ορισμένα γονίδια εκφράζονται και πότε αυτά παραμένουν ανενεργά . Γονίδια των οποίων η έκφραση δεν είναι απαραίτητη για κάποια κυτταρική λειτουργία βρίσκονται σε μεθυλιωμένη μορφή . Ο αριθμός και η τοποθέτηση των μεθυλομάδων προσδίδει ένα ‘σήμα’ σχετικά με το ποια γονίδια δεν πρέπει να εκφραστούν .

Υπάρχουν ακόμη , μερικές πρωτεΐνες στα κύτταρα οι οποίες ειδικά αναγνωρίζουν συγκεκριμένες περιοχές του DNA και ενσωματώνουν τις μεθυλιωμένες κυτοσίνες , εμποδίζοντας με τον τρόπο αυτό την έκφραση των γονιδίων . ( Εικόνα 2.3.5 ) .

Επιπρόσθετα , ορισμένες από τις πρωτεΐνες αυτές δημιουργούν ένα σημαντικό σήμα καθορισμού του βαθμού πτύχωσης μιας περιοχής του DNA . (Εικόνα 2.3.6).

Η αναδίπλωση του μακρύ μορίου του DNA σε μορφή δυνατή να χωρέσει στα κύτταρα μας δεν είναι καθόλου απλή ή μειωμένης σημασίας . Το μήκος του πλήρως ‘ξεδιπλωμένου’ DNA υπολογίζεται πως φθάνει σε ευθεία γραμμή τα δύο μέτρα , ευνόητο είναι λοιπόν , το DNA για να χωρέσει στα μικροσκοπικών διαστάσεων κύτταρά μας να είναι περιτυλιγμένο και συμπαγές . ( Εικόνα 2.3.7 )

Ο τρόπος που το DNA λαμβάνει τη συμπαγή μορφή του διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στον προσδιορισμό των γονιδίων που εγκαθίσταται σε αδρανή μορφή και των αντίστοιχων γονιδίων που μπορούν να εκφραστούν . Γενικά , γονίδια που εντοπίζονται σε περιοχές συμπαγούς χρωματίνης δεν εκφράζονται σε μεγάλο βαθμό , ενώ γονίδια που βρίσκονται σε μια πιο χαλαρή μορφή της χρωματίνης , όχι τόσο στενά πακεταρισμένη , είναι περισσότερο διαθέσιμα και προσιτά στη ‘ μηχανή ’ που μεταγράφει το γονίδιο στην ενδιάμεση μορφή έκφρασής του , δηλαδή το RNA . ( εικόνες 2.3.5 και 2.3.6 ) .

Επιπλέον , εκτός από τον καθορισμό της δραστικότητας ή μη ενός γονιδίου οι διάφορες καταστάσεις της χρωματίνης δύνανται να κληρονομούνται . Eπίσης , μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να εγκαταστήσουν καθώς και να διατηρήσουν πρότυπα γονιδιακής έκφρασης ακόμη και για μεγάλες αποστάσεις DNA και για πολλές κυτταρικές γενιές .Ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα μιας τέτοιας επιρροής της οργάνωσης της χρωματίνης , για μεγάλες αποστάσεις , συμβαίνει στα θηλαστικά , οπού μια μεταβολή στη δομή της χρωματίνης ενός ολόκληρου χρωμοσώματος χρησιμοποιείται για να μειώσει το επίπεδο έκφρασης όλων των γονιδίων αυτού του χρωμοσώματος , όπως συμβαίνει , λόγου χάριν , με την αδρανοποίηση του Χ χρωμοσώματος .

Πρόσφατα , στα σπονδυλωτά βρέθηκε μεθυλιωμένο DNA κατά την αντιγραφή αδρανών περιοχών του γονιδιώματος , όπως στο αδρανές Χ χρωμόσωμα ( το οποίο συναντάται , όπως έχει προαναφερθεί , με τη μορφή της συμπαγούς ετεροχρωματινικής δομής , η οποία δηλαδή αποτελεί το γνωστό σωμάτιο Barr ) . Ακόμη μεθυλιωμένο DNA βρέθηκε και στα γονίδια τα οποία είναι ανενεργά σε συγκεκριμένους ιστούς , υποδηλώνοντας έτσι ότι η μεθυλίωση , με τις αντίστοιχες επιδράσεις που έχει και στη δομή της χρωματίνης διαδραματίζει κάποιο καθοριστικό ρόλο στην αδρανή κατάσταση του γονιδίου .

Μεθυλίωση : μεθυλάσες και απομεθυλάσες του DNA

Τα κύτταρα των σπονδυλωτών περιέχουν μια οικογένεια πρωτεϊνών οι οποίες ενσωματώνουν το μεθυλιωμένο DNA . Οι πρωτεΐνες αυτές , αλληλεπιδρούν με συμπλέγματα χρωματίνης μετασχηματίζοντάς την , επιπλέον με την αποκετυλίωση των ιστονών που παρατηρείται προκαλείται συμπύκνωση της χρωματίνης η οποία δε δύναται υπό τη μορφή αυτή να αντιγραφεί .

Η μεθυλίωση του DNA ελέγχεται από τις μεθυλάσες οι οποίες προσθέτουν μεθυλομάδες στη θέση 5 της κυτοσίνης και από τις απομεθυλάσες οι οποίες σε αντιδιαστολή με τις μεθυλάσες απομακρύνουν τις μεθυλομάδες .

Υπάρχουν πολλών ειδών μεθυλάσες , ένας απλοϊκός διαχωρισμός που θα μας επέτρεπε μια ευκολότερη και ταυτόχρονα πιο κατανοητή προσέγγισή τους είναι η ακόλουθη : , που τις διακρίνει σε δύο βασικές κατηγορίες : στις μεθυλάσες των βακτηρίων και σε αυτές των ευκαρυωτικών κυττάρων . ( βέβαια εννοείται πως αυτός ο διαχωρισμός δεν είναι δεσμευτικός .)

Μεθυλάσες βακτηρίων

Από τις πιο γνωστές μεθυλάσες που έχουν ταυτοποιηθεί στα βακτήρια είναι οι Dam – Methylase ή Dam μεθυλάση και η Dcm – Methylase ή Dcm μεθυλάση, από τις οποίες η πρώτη μεθυλιώνει κυρίως στη θέση Ν 6 της αδενίνης ( εικόνα 2.3.8 ) και σε μικρότερο βαθμό στο άζωτο της κυτοσίνης της αλληλουχίας αυτής : 5’-GATC-3’

Η Dcm – Methylase μεθυλιώνει στη θέση 5 της κυτοσίνης της αλληλουχίας : 5’-CCAGG-3’ ή της : 5’CCTGG-3’ ( Στην εσωτερική κυτοσίνη της αλληλουχίας )

Μεθυλάσες ευκαρυωτών

Αναφορικά με τις μεθυλοτρανσφεράσες των ευκαρυωτών , μπορούμε συνοπτικά να επισημάνουμε τα ακόλουθα :

• Είναι ένζυμα υπεύθυνα για τη μεθυλίωση του DNA
• Έλλειψη τους που προκλήθηκε σε πειράματα που έγιναν σε ποντίκια είχε ως αποτέλεσμα τον πρώιμο θάνατο αυτών .
• Προβλήματα που παρατηρήθηκαν κατά τη μεθυλίωση , αποτέλεσε την αιτία πρόκλησης διαφόρων ανθρώπινων νόσων .
• Απομόνωση γονιδίων dim-2 και dim-5 που κωδικοποιούν μεθυλοτρανσφεράσες ( μεθυλάσες ).
• Εκ των οποίων το γονίδιο Dim- 2 κωδικοποιεί τη μεθυλοτρανσφεράση DNMT 1 ( methyltransferase DNMT 1 ) .
• Υπάρχουν επίσης , οι μεθυλοτρανσφεράσες DNMT3 . Διακρίνουμε την μεθυλοτρανσφεράση DNMT3 α και την DNMT3 β . ( Η οποία συναντάται στον άνθρωπο , στα ποντίκια , στα ψάρια , στη ζέβρα καθώς και σε πολλά ακόμη είδη ).
• Υπάρχει επιπλέον και η μεθυλοτρανσφεράση DNMT2 . ( Η οποία συναντάται στην δροσόφιλα στον , άνθρωπο , καθώς και στα υπόλοιπα θηλαστικά ).
• Πειράματα έχουν αποδείξει στενή συσχέτιση των μεθυλοτρανσφερασών και της διαδικασίας της ογκογένεσης .
• Οι απομεθυλάσες είναι ένζυμα που έχουν ως ρόλο την αφαίρεση μεθυλομάδων .

Μεθυλίωση της κυτοσίνης

Κατά την προσθήκη μιας μεθυλομάδας στην κυτοσίνη ενός μορίου DNA θα πρέπει το μόριο στο σημείο αυτό να ανοίξει τη διπλή του έλικα ώστε να προβάλλεται επί τα εκτός του νοητού κάθετου άξονα του μορίου η αζωτούχος βάση της κυτοσίνης . Όταν η κυτοσίνη βρίσκεται στη θέση αυτή τότε το μόριο του DNA , έχει λάβει μια ευνοϊκή μορφή η οποία επιτρέπει έπειτα , να έρθει η μεθυλοτρανσφεράση ( μεταφέροντας μαζί και την μεθυλομάδα ) , να προσδεθεί στην κυτοσίνη και να την μεθυλιώσει . Με την πρόσδεση αυτή δημιουργείται ένα σύμπλοκο της μεθυλοτρανσφεράσης με το μόριο του DNA γνωστό και με την ονομασία σύμπλοκο μεθυλοτρανσφεράσης - DNA .[ εικόνες 2.3.9 α ) 2.3.9β ) και εικόνα 2.3.10 ) ]

ΕΙΚΟΝΑ 2.3.9 β)

DNMT 1 μεθυλοτρανσφεράση

Σχετικά με την DNMT 1 μεθυλοτρανσφεράση γνωρίζουμε τα ακόλουθα :

• Στον άνθρωπο , το αντίστοιχο γονίδιο που κωδικοποιεί την DNMT 1 μεθυλοτρανσφεράση εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 19 , στο , βραχύ σκέλος του στη θέση : 19ρ 13,2 - 13,3 . Αντιστοίχως στο ποντίκι εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 9 και συγκεκριμένα βρίσκεται κοντά στο κεντρομερίδιο του χρωμοσώματος .
• Υπολογίζεται πως είναι περίπου 190 kDa .
• Πιστεύεται πως υπάρχει σε όλα τα κύτταρα .
• Η μεθυλοτρανσφεράση DNMT 1 χρησιμοποιεί ως πηγή μεθυλομάδων για τη μεθυλίωση του DNA της , την θειο-αδενοσυλομεθειονίνη ( ή αλλιώς S-adenosylmethionine ή συντομογραφικά την S-AdoMet , για την οποία εξάλλου θα κάνουμε ξεχωριστή αναφορά παρακάτω ) .
• Προκαλεί τη μεθυλίωση της κυτοσίνης ( -C ) της αλληλουχίας -CpG- του DNA .
• Η ενεργοποίηση της Dnmt 1 , γίνεται από το ημιμεθυλιωμένο DNA , το οποίο δηλαδή είναι μεθυλιωμένο στον ένα κλώνο του και μη μεθυλιωμένο στον άλλο
• Η DNMT 1 μεθυλοτρανσφεράση έχει ως στόχο τη διατήρηση της μεθυλίωσης καθώς και τη μεταβίβαση του προτύπου μεθυλίωσης και στα σωματικά κύτταρα
• Από πειράματα που έχουν πραγματοποιηθεί σε : Neurosporasacrassa , και Arabidopsis thaliana έχουν δείξει πως η αποκετυλίωση των ιστονών και γενικότερα του DNA ( η οποία λαμβάνει χώρα με τη δράση της αποακετυλάσης των ιστονών : deacetylase HDAC1), είναι απαραίτητη προϋπόθεση για να λάβει η χρωματίνη δομή ικανή για την ενσωμάτωση της Dnmt1 μεθυλοτρανσφεράσης και κατά συνέπεια και για τη διαδικασία της μεθυλίωσης του DNA .
• Παρουσία της μεθυλοτρανσφεράσης Dnmt 1 , παρατηρείται διατήρηση της μεθυλίωσης του DNA , σε ποσοστό 95% του συνόλου των κυτταρικών διαιρέσεων που έγιναν .

Θειο-αδενοσυλομεθειονίνη , S-adenosylmethionine , S-AdoMet

Αναφορικά με την S-adenosylmethionine (S-AdoMet) μπορούμε να επισημάνουμε τα ακόλουθα :

• Η θειο-αδενοσυλομεθειονίνη αποτελεί ένα μεταβολικά δραστικό παράγωγο του αμινοξέος μεθειονίνη ,
• Η ομάδα του μεθυλίου ( –CH3 ) που απαιτείται για την μεθυλίωση της κυτοσίνης της αλληλουχίας CpG του DNA προέρχεται από το θείο της θειο-αδενοσυλομεθειονίνης που έχει ως αποτέλεσμα και την μετατροπή της θειο-αδενοσυλομεθειονίνης στην θειο-αδενοσυλοομοκυστεΐνη ( ή S-Adenosylhomocysteine ) .
• Αποτελεί την πηγή των μεθυλομάδων εκτός από το DNA και για άλλα πολυμερή , όπως για τις πρωτεΐνες , το RNA , επιπλέον και για διάφορους μικρούς μεταβολίτες , όπως για παράδειγμα είναι η νορεπινεφρίνη ( νοραδρεναλίνη ) . (θειο-αδενοσυλομεθειονίνη : εικόνα 2.3.12 )

Μεθυλοτρανσφεράσες DNMT 3

DNMT 3 a μεθυλοτρανσφεράση

• Είναι πρωτεΐνη περίπου 120 kDa
• Εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 2 στο βραχύ σκέλος και συγκεκριμένα στην περιοχή του χρωμοσώματος : 2ρ 23
• Η μεθυλοτρανσφεράση DNMT 3 a έχει ως στόχο την DE NOVO μεθυλίωση του DNA .
• Η ανίχνευσή της έγινε με το αντίσωμα : ΡΑ1-882. ( που πραγματοποιήθηκε σε δείγμα : από κύτταρα HELLA ) .
• Χρησιμοποιούνται σε διάφορες διαδικασίες πειραματικού ελέγχου .

DNMT 3b μεθυλοτρανσφεράση

• Είναι πρωτεΐνη περίπου 130 kDa
• Εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 20 στο μακρύ σκέλος και συγκεκριμένα στην περιοχή του χρωμοσώματος : 20q 11.2
• Η μεθυλοτρανσφεράση DNMT 3 b ( όπως και η DNMT 3 a ) έχει ως στόχο την DE NOVO μεθυλίωση του DNA .
• Η ανίχνευσή της έγινε με το αντίσωμα : ΡΑ1-884 .
• Χρησιμοποιούνται και αυτές σε διάφορες διαδικασίες πειραματικού ελέγχου .

ΜΕΘΥΛΙΩΣΗ – ΔΟΜΗ DNA - ΜΕΘΥΛΟΤΡΑΝΣΦΕΡΑΣΕΣ ΚΑΙ ΔΟΓΜΑ WATSON – CRICK

Παρατηρείται αντίθεση ανάμεσα στο μοντέλο – πρότυπο της διπλής έλικας του DNA ( σύμφωνα με την θεωρία των : WATSON - CRICK ) και της διαδικασίας της μεθυλίωσης του . Αυτό γίνεται ιδιαίτερα εμφανές στις δύο ακόλουθες επισημάνσεις :

1. Η ύπαρξη επιγενετικών πληροφοριών

Με τον όρο αυτό εννοούμε τις πληροφορίες που δεν προκύπτουν άμεσα από την αλληλουχία των νουκλεοτιδίων του DNA αλλά έμμεσα από τα ‘σήματα’ που αυτό φέρει , όπως είναι για παράδειγμα τα ‘σήματα’ που φέρει το DNA τα οποία καθορίζουν ποιες κυτοσίνες και πού πρόκειται να μεθυλιωθούν . Οι επιγενετικές πληροφορίες συμπεραίνουμε λοιπόν πως έχουν τεράστια και καθοριστική σημασία στα κύτταρα .

Οι επιδράσεις τους είναι ιδιαίτερα αντιληπτές στις διάφορες βιολογικές λειτουργίες των : ΠΡΟΚΑΡΥΩΤΩΝ καθώς και των ΕΥΚΑΡΥΩΤΩΝ

2. Β-DNA και Ζ –DNA

Η αντίθεση αυτή αφορά στον ασυνήθιστο τρόπο δράσης των μεθυλοτρανσφερασών , για την δράση των οποίων απαιτείται το DNA να λάβει στην πραγματικότητα μια δομή διαφορετική από αυτή της δεξιόστροφης διπλής του έλικας ( γνωστής και ως Β-DNA – φαίνεται στην εικόνα 13 - ) . Έτσι , προκύπτει το DNA να έχει τη μορφή μιας αριστερόστροφης διπλής έλικας ( δομή γνωστή επίσης και με το συμβολισμό Ζ –DNA φαίνεται στην εικόνα 14- ). Δηλαδή , το DNA από τη μορφή του Β-DNA μεταπίπτει σε αυτή του Ζ –DNA . (Σύγκριση της δομής της εικόνας 13 με αυτή της εικόνας 14) .

Από σύγκριση των εικόνων 13 και 14 προκύπτουν τα ακόλουθα :

• Η διπλή έλικα του Z - DNA σε αντίθεση τη Β μορφή είναι αριστερόστροφη ενώ στο B DNA είναι δεξιόστροφη .
• Μια άλλη σημαντική διαφορά είναι ότι στο Z DNA οι φωσφορικές ομάδες περιελίσσονται σε διάταξη zig – zag – για το λόγο αυτό άλλωστε πήρε και το όνομα αυτό , σε αντιδιαστολή με το Z DNA στο B DNA οι φωσφορικές ομάδες περιελίσσονται ομαλά με εμφανή περιοδικότητα .
• Μια ακόμη διαφορά που παρατηρείται είναι ότι το Z DNA εμφανίζει μία μόνο αύλακα ( groove ) , ενώ στο B DNA , όπως φαίνεται και από την εικόνα περιέχει δύο αύλακες μία μεγάλη και μία μικρή αύλακα ( Major groove και Minor groove ) .

Αξίζει να επισημανθεί πως για την δημιουργία του Z DNA προϋπόθεση αποτελεί η ύπαρξη εναλλασσόμενων αλληλουχιών βάσεων πουρίνης και πυριμιδίνης όπως για παράδειγμα η εναλλαγή των αζωτούχων βάσεων κυτοσίνης -C- ( πυριμιδίνη ) και γουανίνης -G- ( πουρίνη ) δηλαδή της μορφής : -…CGCGCGCGCGCGCG…- όπως συναντάται για παράδειγμα στις νησίδες CpG όπου παρουσιάζεται σημαντικά υψηλότερο ποσοστό γουανίνης και κυτοσίνης σε σύγκριση με το μέσο όρο που υπάρχει στο υπόλοιπο μόριο του DNA .

Η μετατροπή μιας εναλλασσόμενης αλληλουχίας πυριμιδίνης – πουρίνης από B-DNA σε Z-DNA επιτυγχάνεται με τη στροφή των ζευγαριών των βάσεων CG κατά 180ο και την ταυτόχρονη στροφή των σακχάρων της πουρίνης . Ο σχηματισμός της μορφής του Z DNA ευνοείται , εκτός των άλλων και από την μεθυλίωση της κυτοσίνης στη θέση 5 του άνθρακα .

Η μεθυλίωση του DNA στα σπονδυλωτά συμβάλλει στην σταθεροποίηση της αδρανοποίησης .

Παρόλα αυτά , η μεθυλίωση του DNA δεν είναι αρκετή ώστε να σηματοδοτήσει από μόνη της την διαδικασία της αδρανοποίησης ενός γονιδίου, όπως αποδεικνύουν τα ακόλουθα παραδείγματα :

Πλασμίδιο DNA το οποίο περιλαμβάνει ένα συγκεκριμένο μυϊκό γονίδιο μπορεί να μετατραπεί in vitro και στην πλήρως μεθυλιωμένη καθώς και στην μη μεθυλιωμένη μορφή του , χρησιμοποιώντας για τον σκοπό αυτό βακτηριακές πρωτεΐνες ικανές να μεθυλιώνουν και να απομεθυλιώνουν το DNA . Όταν οι δύο αυτές διαφορετικές εκδοχές του DNA του πλασμιδίου εισαχθούν σε αναπτυσσόμενα μυϊκά κύτταρα, το μεθυλιωμένο πλασμίδιο αντιγράφεται στον ίδιο βαθμό όπως και το μη μεθυλιωμένο .

Επιπλέον , όταν ένα σιωπηλό μεθυλιωμένο γονίδιο ενεργοποιείται κατά τη διάρκεια της φυσιολογικής πορείας της ανάπτυξης , η μεθυλίωση χάνεται μόνο μετά αφού το γονίδιο έχει αντιγραφεί για κάμποσο χρονικό διάστημα .

Τελικά , κατά τη διάρκεια της αδρανοποίησης του Χ χρωμοσώματος , συμπύκνωση και αποσιώπηση , παρατηρούνται πριν μια αύξηση στα επίπεδα της μεθυλίωσης του DNA μπορεί να ανιχνευθεί .

Από όλα αυτά τα αποτελέσματα συνάγεται ότι η μεθυλίωση αυξάνει την καταστολή της αντιγραφής , η οποία καταρχήν εγκαθίσταται από άλλους μηχανισμούς ( Xist – RNA ) . Η μεθυλίωση του DNA φαίνεται πως χρησιμοποιείται στα σπονδυλωτά κυρίως στο να διασφαλίσει ότι όταν ένα γονίδιο αδρανοποιείται τότε αυτό καταστέλλεται εντελώς (σταθεροποίηση αδρανοποίησης ) .

Αξιοπερίεργο γεγονός πάντως είναι , το πώς ένα ολόκληρο χρωμόσωμα όπως στην περίπτωση του Χ χρωμοσώματος καθίσταται ανενεργό . Η αδρανοποίηση του Χ χρωμοσώματος (όπως έχει περιγραφεί εκτενέστερα παραπάνω ) ξεκινάει και εξαπλώνεται από ένα συγκεκριμένο τμήμα , στο μέσον περίπου αυτού , το γνωστό ως : ανενεργό κέντρο του Χ χρωμοσώματος XIC (x-inactivation center ) . Σε πειράματα όπου τμήματα του ανενεργού Χ χρωμοσώματος μετακινούνται μακριά από το XIC και μεταφέρονται σε ένα αυτόσωμα παρατηρείται πως ‘ξεφεύγουν’ από την πρώην αδρανοποιημένη κατάστασή τους και εκφράζονται . Αντίθετα , τμήματα αυτοσωμικών χρωμοσωμάτων , τα οποία μεταφέρονται στο XIC ενός ανενεργού Χ χρωμοσώματος υπόκεινται σε ‘σιωπηλή’ αντιγραφή . Με απώλεια της περιοχής του ΧIC έχουμε ως αποτέλεσμα τη διατήρηση της αδρανοποίησης του Χ Το κέντρο αδρανοποίησης XIC ( μια αλληλουχία DNA περίπου ενός εκατομμυρίου ζεύγη νουκλεοτιδίων ) μπορεί επομένως , να θεωρείται ως ένα μεγάλο ρυθμιστικό στοιχείο , το οποίο συμβάλλει στην εξάπλωση της ετεροχρωματινικής μορφής της χρωματίνης διευκολύνοντας ταυτόχρονα και την εξάπλωση της δομής αυτής σε ολόκληρο το χρωμόσωμα . Το κέντρο XIC περιλαμβάνει ένα γονίδιο που αποκαλείται XIST, το οποίο όταν μεταγράφεται δίνει ένα ασυνήθιστο μόριο RNA , το XIST - RNA ,το οποίο εκφράζεται μόνο από το ανενεργό Χ χρωμόσωμα και η έκφρασή του οποίου είναι απαραίτητη για την αδρανοποίηση του χρωμοσώματος . Η εξάπλωση του XIST – RNA από το κέντρο XIC σε ολόκληρο το χρωμόσωμα συσχετίζεται με την ταυτόχρονη εξάπλωση και των γονιδίων σε αδρανοποιημένη μορφή , καταδεικνύοντας κατά τον τρόπο αυτό ότι το XIST – RNA συμμετέχει στο σχηματισμό και την εξάπλωση της ετεροχρωματίνης .

Τέλος ,. το XIST – RNA έχει δειχθεί πως είναι απαραίτητο για την μύηση του Χ χρωμοσώματος σε αδρανή κατάσταση αλλά όχι όμως ότι απαιτείται και για τη διατήρηση αυτής της αδρανούς μορφής . Μελέτες κατά τις οποίες έγινε απομεθυλίωση του DNA , χρησιμοποιώντας 5-azacytidine ή εισάγοντας μια μετάλλαξη στο γονίδιο Dnmt1 για την μεθυλοτρανσφεράση και εμποδίζοντας ταυτόχρονα την αποκετυλίωση των ιστονών της χρωματίνης ( χρησιμοποιώντας trichostatin A ) κατέδειξαν μια συνεργητική αλληλεπίδραση μεταξύ των μηχανισμών που λαμβάνουν χώρα , για την αδρανοποίηση του Χ χρωμοσώματος .

Άρα το XIST - RNA ( του γονιδίου XIST ) είναι αναγκαίο για την έναρξη της αδρανοποίησης του Χ χρωμοσώματος όχι και για διατήρησή της . Η μεθυλίωση , συνεπώς , δεν είναι αρκετή από μόνη της να σηματοδοτήσει την αδρανοποίηση .

Επιπροσθέτως η αδρανοποίηση του Χ χρωμοσώματος εμφανίζει κάποια διακριτά χαρακτηριστικά . Στα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά που εμφανίζει ένα αδρανές Χ χρωμόσωμα , περιλαμβάνονται τα ακόλουθα , στα οποία άλλωστε και θα αναφερθούμε :

• Η μεθυλίωση των CpG αλληλουχιών ( έχουμε αναφερθεί για τη μεθυλίωση των νησίδων αυτών προηγουμένως )
• Η παρουσία μιας ειδικής ποικιλίας της ιστόνης Η2α
• Η μεθυλίωση μιας συγκεκριμένης περιοχής της ιστόνης Η3
• Η υποακετυλίωση των ιστονών Η3 και Η4
• Η μεθυλίωση , η υποακετυλίωση καθώς και η πρόσδεση των MeCP1 και MeCP2 .
• Η έκφραση του γονιδίου XIST και η παραγωγή του XIST – RNA ( στα οποία μόλις αναφερθήκαμε ) .
• Η δομή της ετεροχρωματίνη και η συμπύκνωση που παρατηρούνται στο DNA .

Πιθανόν , όλα αυτά τα γεγονότα να λαμβάνουν χώρα αργότερα , ως ένα μέρος του όλου μηχανισμού της αδρανοποίησης του χρωμοσώματος Χ και με συνέπεια να καθιστούν το χρωμόσωμα ασυνήθιστα ανθεκτικό στην διαδικασία της αντιγραφής .

ΜΕΘΥΛΙΩΣΗ ΙΣΤΟΝΗΣ Η3

Γενικά για τη μεθυλιωμένη ιστόνη Η3 πρέπει να επισημάνουμε τα ακόλουθα :

• Παρουσία μεθυλιωμένης ιστόνης Η3 παρατηρείται υψηλή οργάνωση της χρωματίνης ενώ το χρωμόσωμα Χ καθίσταται ανενεργό .
• Η ιστόνη Η3 , η οποία εμφανίζει μεθυλιωμένη την λυσίνη της στη θέση 9 ( γνωστή και ως Η3 Lys 9 - methyl ή συντομογραφικά ως Me ( Κ9 ) Η3 παρατηρείται στη ‘ σιωπηλή ’ χρωματίνη .
• Σε αντίθεση όταν η ιστόνη Η3 , εμφανίζεται μεθυλιωμένη στην λυσίνη που φέρει στη θέση 4 ( γνωστή άλλωστε και ως Η3 Lys4-methyl ή συντομογραφικά ως Me ( Κ4 ) Η3 , τότε το DNA παρουσιάζεται ‘ ενεργό ’ και επιπλέον η χρωματίνη με τη μορφή της ευχρωματίνης η οποία δύναται να μεταγραφεί

ΕΝΖΥΜΑ : rhp6 και ubc

Τα ένζυμα αυτά αποτελούν αρνητικούς ρυθμιστές της διαδικασίας της αδρανοποίησης . Υπερέκφραση των αντίστοιχων γονιδίων που τα κωδικοποιούν οδηγούμαστε σε αναστολή της αδρανοποίησης . ( Παρατηρείται κυρίως στην περιοχή του κεντρομεριδίου καθώς επίσης και στα τελομερίδια) .

Σχετικά με τα αντίστοιχα επίπεδα μεθυλιωμένων λυσινών παρατηρούνται τα ακόλουθα :

Τα επίπεδα της μεθυλιωμένης λυσίνης στην θέση 9 , ( Lys 9 - methyl ή Me ( Κ9 ) Η3 είναι μειωμένα . Σε αντίθεση τα επίπεδα της μεθυλιωμένης λυσίνης στην θέση 4 , ( Lys 4 - methyl ή Me ( Κ4) Η3 ) είναι συγκριτικά αυξημένα .

Σε πειράματα όπου τα γονίδια που κωδικοποιούν τα ένζυμα rhp6 και ubc είχαν διαγραφεί παρατηρείται αύξηση της αδρανοποίησης σε όλες τις ετεροχρωματικές περιοχές . Επιπλέον εντοπίζεται τώρα μια αύξηση στα επίπεδα της Me ( Κ9 ) Η3 ενώ και πάλι σε αντίθεση με τη μεθυλιωμένη λυσίνη Me ( Κ9 ) Η3 τα επίπεδα της μεθυλιωμένης λυσίνης στη θέση 4 Me(Κ4) Η3 είναι μειωμένα .

Δομή Μεθυλιωμένης λυσίνης

Το αμινοξύ λυσίνη ενωμένο με άλλα σε μια πολυπεπτιδική αλυσίδα η οποία φέρει αμινοξέα με πλευρικές ομάδες R1 , R2 κ.ο.κ. Παρουσιάζεται η δομή της λυσίνης :

ΜΕ ΜΕΘΥΛΙΩΣΗ ΤΗΣ ΛΥΣΙΝΗΣ ΤΗΣ ΙΣΤΟΝΗΣ ΚΑΙ ΠΡΟΣΘΗΚΗ ΜΕΘΥΛΟΜΑΔΑΣ ( -CH3 ) :

Στο σχεδιάγραμμα αυτό , παρουσιάζεται εν μέρει η διαδικασία της μεθυλίωσης του αμινοξεος λυσίνης σε ένα πολυπεπτιδικό τμήμα που βρίσκεται σε ένα μέρος της ιστονης . ( Το τμήμα στο οποίο εντοπίζεται η προστιθέμενη ομάδα του μεθυλίου του αμινοξεος λυσινη είναι το άζωτο της πλευρικής ομάδας του αμινοξεος και έχει επισημανθεί με το ορθογώνιο περίγραμμα ) .

Η μεθυλίωση της ιστόνης Η3 στη λυσίνη της στη θέση 9 , ( Lys 9 Me ( Κ 9) Η3 ) εντοπίζεται , όπως έχει ήδη αναφερθεί , στο αδρανοποιημένο Χ χρωμόσωμα και συμβαίνει αμέσως μετά τη δράση του XIST – RNA . Ταυτόχρονα λαμβάνουν χώρα η υποακετυλίωση της Η3 Lys 9 και η υπομεθυλίωση της Η3 Lys 4 .

ΑΔΡΑΝΟΠΟΙΗΣΗ ΓΟΝΙΔΙΩΝ

Μηχανισμός δράσης της μεθυλίωσης

ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ 1. ΤΗΣ ΕΙΚΟΝΑΣ 2.3.16. Παρατηρούμε πως στην περίπτωση αυτή η μεθυλίωση των νησίδων κυτοσίνης – γουανινης C p G ; έχει ως αποτέλεσμα την καταστολή της μεταγραφής των γονίδιων .

ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ 2. ΤΗΣ ΕΙΚΟΝΑΣ 2.3.16. Στην περίπτωση αυτή δίνεται έμφαση στο γεγονός ότι η μεθυλίωση εμφανίζει κυρίως τοπικό χαρακτήρα αδρανοποίησης , με την έννοια ότι οι γειτονικές περιοχές που περιέχουν και αυτές νησίδες κυτοσίνης – γουανινης οι οποίες όμως είναι μη μεθυλιωμένες μεταγράφονται ανεξάρτητα αν σε κοντινή απόσταση από αυτές υπάρχουν τμήματα του DNA που έχουν υποστεί μεθυλίωση και δε μεταγράφονται .

ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ 3. ΤΗΣ ΕΙΚΟΝΑΣ 2.3.16. Η ύπαρξη καταστολέα στις νησίδες κυτοσίνης – γουανινης δεν επηρεάζει τη μεταγραφή μόνο των γονίδιων αυτών των τμημάτων του DNA αλλά , και των άλλων γονίδιων που βρίσκονται σε κοντινή και μη απόσταση από αυτές . Ενώ , όπως έχουμε αναφέρει και στην προηγούμενη περίπτωση η μεθυλίωση παρουσιάζει τοπικό χαρακτήρα καταστολής της μεταγραφής και συνεπώς τα γονίδια που βρίσκονται σε κοντινή απόσταση από μεθυλιωμένες περιοχές μπορούν και μεταγράφονται .

ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ 4. ΤΗΣ ΕΙΚΟΝΑΣ 2.3.16. Παρουσία του καταστολέα και ταυτόχρονα και του ενεργοποιητή στις νησίδες - C p G - ( κυτοσίνης – γουανίνης ) ενός γονίδιου του DNA παρατηρούμε πως το γονίδιο αυτό μπορεί και μεταγράφεται ενώ , τα γονίδια που βρίσκονται κοντά στην περιοχή αυτή παραμένουν αδρανοποιημένα και δεν μπορούν να μεταγράφουν . Αντίστοιχα με την περίπτωση αυτή , αν αντί για την ύπαρξη ενός καταστολέα οι νησίδες - C p G - (κυτοσίνης – γουανινης ) βρίσκονταν υπό τη μεθυλιωμένη τους μορφή , τότε στην περίπτωση αυτή - και παρουσία του ενεργοποιητή - οι νησίδες του DNA θα παρέμεναν μεταγραφικά αδρανείς ενώ , τα γονίδια που βρίσκονται σε κοντινή απόσταση από το μεθυλιωμένο τμήμα του DNA στην περίπτωση αυτή ( σε αντίθεση με την προαναφερθείσα ) δεν παραμένουν κατασταλμένα αλλά , μπορούν και μεταγράφονται .

Από την εικόνα 2.3.17 , συμπεραίνουμε πως : και η υποακετυλίωση των ιστονών και ιδιαίτερα η υποακετυλίωση της ιστονης Η4 ( η οποία μπορεί να γίνει με την δράση της HDAC ) , συμβάλλει και μάλιστα ευνοεί την διαδικασία της μεθυλίωσης του DNA . Επίσης διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο και στο να προσλάβει η χρωματίνη τη δομή της συμπαγούς ετεροχρωματίνης και στο να καθίσταται με τον τρόπο αυτό , το γονίδιο μεταγραφικά αδρανές .

ΣΧΕΤΙΚΑ ΜΕ ΤΗΝ ΑΔΡΑΝΟΠΟΙΗΣΗ - ΤΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ - ΤΗ ΜΕΘΥΛΙΩΣΗ ΚΑΙ ΤΗΝ ΑΠΟΚΕΤΥΛΙΩΣΗ ΤΟΥ DNA

ΕΙΚΟΝΑ 2.3.18

ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ ΤΗΣ ΕΙΚΟΝΑΣ 2.3.18

ΕΙΚΟΝΑ 2.3.18. ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ : 2.3.18/1

Από το σχεδιάγραμμα αυτό , γίνεται αντιληπτό πως παρουσία της μεθυλίωσης το DNA δεν μπορεί να μεταγράφει . Έτσι ενώ , υπό φυσιολογικές συνθήκες μπορεί στο DNA να προσδεθούν ο παράγοντας TF καθώς και η πολυμεραση ΙΙ ( POL II ) , οι οποίοι είναι αναγκαίοι και απαραίτητοι παράγοντες για την έναρξη της διαδικασίας της μεταγραφής του dank και άρα να αρχίσει η μεταγραφή αυτού . Αντιθέτως όταν υπάρχουν μεθυλομάδες και το DNA βρίσκεται δηλαδή υπό τη μεθυλιωμένη του μορφή ούτε ο παράγοντας TF αλλά ούτε και η πολυμεραση ιι μπορούν να προσδεθούν σε αυτό και καθαυτό τον τρόπο δεν είναι εφικτό πλέον η έναρξη της μεταγραφής του DNA .

ΕΙΚΟΝΑ 2.3.18. ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ : 2.3.18/2

Στο α / έχουμε την ‘ κανονική ’ πρόσδεση του παράγοντα TF καθώς και της πολυμεράσης ΙΙ ( POL II ) , και την έναρξη της μεταγραφής .

Στο β / παρουσιάζεται η περίπτωση κατά την οποία το DNA βρίσκεται στη μεθυλιωμένη του μορφή . Στην κατάσταση αυτή προσδένεται στο DNA η πρωτεΐνη MeCP - 1 . Λόγω της παρουσίας της πρωτεΐνης MeCP – 1 στο τμήμα αυτό του γενετικού υλικού εμποδίζεται η πρόσδεση του παράγοντα TF καθώς και της πολυμερασης ΙΙ ( POL II ) , και κατά συνέπεια και η έναρξη της διαδικασίας της μεταγραφής .

Στο c / παρουσιάζεται τώρα μια παρόμοια η περίπτωση με αυτή της β / . Και στο παράδειγμα αυτό το DNA βρίσκεται με τη μορφή της μεθυλιωμένης του δομής . Στην κατάσταση αυτή προσδένεται τώρα στο DNA η πρωτεΐνη MeCP - 2 . Η πρόσδεση αυτή της πρωτεΐνης καθώς και η ταυτόχρονη υποακετυλίωση ( η οποία πραγματοποιείται με τη δράση της ΗDAC ) που συμβαίνει στο DNA εμποδίζουν την πρόσδεση του παράγοντα TF και της πολυμερασης ΙΙ ( POL II ) , και συνεπώς , και την έναρξη της μεταγραφής του DNA .

ΕΙΚΟΝΑ 2.3.18. ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ : 2.3.18/3

Με το σχήμα της εικόνας αυτής δίνεται έμφαση στο γεγονός ότι λόγω της μεθυλίωσης που υφίσταται το ίδιο το DNA , έχει ως αποτέλεσμα, να λάβει αυτό ταυτόχρονα μια συμπαγή δομή , η οποία αποδίδεται στο DNA με την πιο συμπυκνωμένη του μορφή . Στην κατάσταση αυτή το DNA εμφανίζεται αρκετά ανθεκτικό στη δράση της Dnase 1 και έτσι , αυτή δεν μπορεί να προσδεθεί και να το κόψει σε θραύσματα . Στην συμπαγή αυτή κατάσταση του DNA όπως είναι εύλογο δεν μπορεί να προσδεθεί ούτε και ο παράγοντας TF , και άρα εμποδίζεται και η έναρξη της μεταγραφής .

5 – AZACYTIDINE

Σχετικά με τη συμπύκνωση ( γενικά εικόνες 2.3.17, 2.3.19 , καθώς επίσης και οι εικόνες 2.3.3 , 2.3.5 και 2.3.6 ) που υφίσταται το DNA εξαιτίας της μεθυλίωσής του πρέπει να κάνουμε μια ιδιαίτερη αναφορά στην 5 – AZACYTIDINE .

Η 5 – AZACYTIDINE ( της οποίας η δομή δίνεται στην εικόνα 2.3.19 ) , εμφανίζει δομή παρόμοια με αυτή της κυτοσίνης ( -C ) του DNA . Μια διαφορά που παρουσιάζει συγκριτικά με την αντίστοιχη δομή της κυτοσίνης είναι ότι η 5 – AZACYTIDINE περιέχει στη θέση 5 του δακτυλίου της άζωτο ( -Ν ) αντί άνθρακα και συνεπώς δε δύναται να μεθυλιωθεί .Η 5 – AZACYTIDINE . Αποτελεί πιθανό ‘φάρμακο-θεραπεία’ για τον καρκίνο μιας και εμποδίζει ή καλύτερα συμβάλλει στο να απομεθυλιωθεί το DNA . Η μεθυλίωση του DNA και ιδιαίτερα περιοχών του όπου υπάρχουν ογκοκατασταλτικά γονίδια γνωρίζουμε πως αποτελεί μια βασική αιτία για την ανάπτυξη νεοπλασμάτων .

ΔΟΜΗ ΤΗΣ 5 – AZACYTIDINE

ΓΙΑ ΤΗ ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΤΩΝ ΔΟΜΩΝ ΤΗΣ ΚΥΤΟΣΙΝΗΣ , ΤΗΣ ΜΕΘΥΛΙΩΜΕΝΗΣ ΚΥΤΟΣΙΝΗΣ ΚΑΙ ΤΗΣ 5 – AZACYTIDINE ΠΑΡΑΤΙΘΕΤΑΙ Η ΕΙΚΟΝΑ 2.3.21.

Μεθυλίωση και σύνδρομο του εύθραυστου Χ χρωμοσώματος

Η μεθυλίωση σχετίζεται όπως έχουμε αναφέρει με την αδρανοποίηση ή διαφόρων γονιδίων ή ακόμη και ολόκληρων χρωμοσωμάτων . Στις θήλεις η διαδικασία της μεθυλίωσης χρησιμοποιείται συχνά για την επίλυση κάποιων προβλημάτων .Οι άνδρες έχουν ένα μόνο Χ χρωμόσωμα ενώ οι γυναίκες διαθέτουν δύο αντίγραφα του χρωμοσώματος , με αποτέλεσμα οι θήλεις να μπορούσαν να παράγουν διπλάσια ποσότητα πρωτεϊνών του Χ χρωμοσώματος από την αντίστοιχη ποσότητα των αρρένων . Εντούτοις , τα θηλυκά κύτταρα διαλέγουν στην τύχη ένα από τα δύο Χ χρωμοσώματα που διαθέτουν και το καθιστούν ανενεργό με τη διαδικασία της μεθυλίωσης αυτού . Έτσι , λοιπόν , και άνδρες και γυναίκες έχουν ένα ενεργό Χ χρωμόσωμα σε κάθε κύτταρό τους και με αποτέλεσμα , μια δραστική μονάδα όλων των γενετικών πληροφοριών του Χ χρωμοσώματος . Μεθυλίωση είναι γενικά μια εξαιρετικά χρήσιμη μέθοδος για την αδρανοποίηση χρωμοσωμικών πληροφοριών . Εντούτοις στην περίπτωση του Fragile X syndrome ( σύνδρομο του εύθραυστου Χ χρωμοσώματος ή fraXq27 ) η μεθυλίωση συμμετέχει στην πρόκληση της ασθένειας . Κοντά στο γονίδιο FMR 1 ( Fragile X Mental Retardation 1 gene ) υπάρχει μια ρυθμιστική περιοχή αποτελούμενη από επαναλαμβανόμενες CpG αλληλουχίες νουκλεοτιδίων . Στους περισσότερους ανθρώπους το τμήμα αυτό δεν είναι μεθυλιωμένο . Με αποτέλεσμα , το κύτταρο να μπορεί να χρησιμοποιήσει το γονίδιο FMR 1 , ( το οποίο εντοπίζεται στο Χ χρωμόσωμα στο μακρύ σκέλος του , και συγκεκριμένα στην περιοχή του 27,3 ( Χ q 27,3 ) για την παραγωγή της πρωτεΐνης FMRP ( Fragile X Mental Retardation Protein ) που κωδικοποιεί όποτε χρειάζεται . Σε ανθρώπους που εμφανίζουν το σύνδρομο του ευαίσθητου Χ χρωμοσώματος , η αλληλουχία CpG είναι μεθυλιωμένη . Κατά συνέπεια το κύτταρο αδυνατεί να αποκωδικοποιήσει και να μεταγράψει το γονίδιο FMR 1 στο αντίστοιχο mRNA του και με αποτέλεσμα να μην δύναται να συνθέσει την πρωτεΐνη FMRP του .Από τη στιγμή που δεν συντίθεται η πρωτεΐνη FMRP και εμφανίζεται έλλειψή της , τη στιγμή και στο μέρος που χρειάζεται , τότε τα συμπτώματα του συνδρόμου του εύθραυστου Χ τίθενται σε εφαρμογή . Βέβαια , αδιευκρίνιστο παραμένει το γεγονός γιατί η ύπαρξη πολλών επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών CpG θέτει σε ενέργεια τη διαδικασία της μεθυλίωσης .

Θεωρητικά , εάν η μεθυλίωση μπορούσε να απομακρυνθεί από το μέρος αυτό του γονιδίου FMR 1 , τότε θα μπορούσε να επιτρέψει την συναρμολόγηση του FMRP προϊόντος του .

Αυτή είναι μια πιθανή αντιμετώπιση του φαινομένου αυτού στην οποία έχει εκδηλωθεί ιδιαίτερο ενδιαφέρον και προσοχή .

Η αδρανοποίηση στις θήλεις του Χ χρωμοσώματος με τη διαδικασία της μεθυλίωσης , που αναφέρθηκε προηγουμένως , φαίνεται , επίσης ,πως εν μέρει καθορίσει την επίδραση που ενδέχεται να έχει το σύνδρομο αυτό στις γυναίκες. Κάθε κύτταρο στις θήλεις θα απενεργοποιήσει το ένα από τα δύο Χ χρωμοσώματα που φέρει . Εάν σε μεγάλη αναλογία των κυττάρων το χρωμόσωμα το οποίο έχει αδρανοποιηθεί είναι αυτό που φέρει την μετάλλαξη , τότε , τα περισσότερα κύτταρα θα διαθέτουν ένα ενεργό χρωμόσωμα το οποίο θα είναι ικανό να παράγει την πρωτεΐνη FMRP , έτσι, συνεπάγεται πως οι επιπτώσεις που θα έχει το σύνδρομο του εύθραυστου Χ χρωμοσώματος θα είναι πιο περιορισμένες . Σε αντίθεση , εάν ένα μεγάλο ποσοστό των κυττάρων αδρανοποιήσουν το χρωμόσωμα Χ που φέρει το φυσιολογικό γονίδιο FMR 1 , που είναι ικανό να παράγει την πρωτεΐνη FMRP θα έχει ως αποτέλεσμα η επίδραση των συμπτωμάτων του συνδρόμου να είναι πιο εμφανείς και δυσμενείς στην περίπτωση αυτή . Έτσι η δριμύτητα των αποτελεσμάτων που θα έχει το σύνδρομο αυτό σε μια γυναίκα εξαρτώνται από το εάν τα κύτταρά της θα θέσουν σε αδρανή κατάσταση το χρωμόσωμα Χ που εμφανίζει την μετάλλαξη ή αντίστοιχα το φυσιολογικό Χ χρωμόσωμα με το ενεργό γονίδιο FMR 1 .

Είναι εύλογο , λοιπόν , ότι το σύνδρομο αυτό που χαρακτηρίζεται από συμπτώματα κυρίως σοβαρής πνευματικής καθυστέρησης να παρατηρείται σε μεγαλύτερη συχνότητα στους άνδρες παρά στις γυναίκες , μιας και αυτοί φέρουν ένα μόνο Χ χρωμόσωμα . Χαρακτηριστικά αναφέρεται πως περίπου πέντε στους δέκα χιλιάδες άρρενες εμφανίζουν το σύνδρομο αυτό , ενώ , περίπου δύο στις δέκα χιλιάδες γυναίκες αντίστοιχα .

ΜΕΘΥΛΙΩΣΗ ΤΟΥ DNA ΚΑΙ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΟΓΚΟΓΕΝΕΣΗΣ

ΜΕΘΥΛΙΩΣΗ-ΚΑΡΚΙΝΟΓΕΝΕΣΗ

Όπως έχουμε ήδη αναφέρει ,με διάφορα πειράματα που έχουν πραγματοποιηθεί ,υποστηρίζεται η άποψη πως η μεθυλίωση του DNA σχετίζεται και με την διαδικασία της ανάπτυξης του καρκίνου .

Αναφορικά , μπορούμε να επισημάνουμε τα ακόλουθα :

• Η μεθυλίωση των υποκινητών επιφέρει γενικά μεταβολή στην δραστικότητα των αντίστοιχων γονιδίων .
• Έτσι , η μεθυλίωση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων έχει ως αποτέλεσμα να λάβουν αυτά τη δομή της ετεροχρωματίνης και κατά συνέπεια , να υποκαθίστανται ανενεργά .
• Αντίθετα , υπομεθυλιωμένα γονίδια τα οποία είναι υπεύθυνα για ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό του κυττάρου έχουν ως αποτέλεσμα , την υπερέκφραση αυτών . ( τα οποία είναι γνωστά και με την ονομασία πρωτοογκογονίδια ) .

Όλα αυτά σε συνδυασμό με επιπλέον παράγοντες που δημιουργούν μια προδιάθεση για την ανάπτυξη του καρκίνου καθώς και τα διάφορα πειράματα που έχουν πραγματοποιηθεί όπως αυτά με την με την 5-azacytidine , που έχουμε ήδη αναφέρει παραπάνω , ενισχύουν την άποψη της ύπαρξης συσχέτισης μεταξύ της μεθυλίωσης του DNA και της διαδικασίας ανάπτυξης του καρκίνου .

Εντούτοις , στο πρότυπο αυτό συσχέτισης έχουν παρατηρηθεί και κάποια αντικρουόμενα γεγονότα , όπως : Σε 5 δείγματα ιστών με καρκίνο ωοθηκών προέκυψαν τα εξής :

• Και τα 5 δείγματα βρέθηκαν υπομεθυλιωμένα σε βαθμό στατιστικά σημαντικό ρ<0.05
• Και στα 5 δείγματα ιστών παρατηρήθηκε υπερέκφραση των γονιδίων DNMT 3a και DNMT 3b τα οποία κωδικοποιούν τις αντίστοιχες μεθυλοτρανσφεράσες DNMT 3a και DNMT 3b , οι οποίες προκαλούν την DE NOVO μεθυλίωση του DNA .
• Ενώ μόνο σε δύο από αυτά τα δείγματα ιστών παρατηρήθηκε υπερέκφραση του DNMT1 γονιδίου το οποίο κωδικοποιεί και την αντίστοιχη μεθυλοτρανσφεράση DNMT1 .

Όπως , γίνεται αντιληπτό παρατηρείται το εξής παράδοξο : να συμβαίνει ταυτόχρονη υπομεθυλίωση και υπερέκφραση των DNMΤs . Βέβαια , δεν είναι τόσο απλά μιας και πολλές άλλες άγνωστες και αδιευκρίνιστες αιτίες και παράμετροι συμβάλλουν στην ογκογένεση , η διαδικασία της ανάπτυξης του καρκίνου είναι μια πολυπαραγοντική και πολυμορφική νόσος και η μεθυλίωση του DNA απλώς αποτελεί μια πτυχή αυτής που δεν έχει ακόμη πλήρως διευκρινιστεί .

Ανασκόπηση : Στην ενότητα αυτή έγινε μια προσπάθεια παρουσίασης της μεθυλίωσης του DNA με ιδιαίτερη έμφαση στη μεθυλίωση του Χ χρωμοσώματος και της αδρανοποίησης αυτού . Έγινε προσπάθεια ορισμού του φαινομένου της μεθυλίωσης , επιπλέον έγινε αναφορά για τη μεθυλίωση και τις μεθυλοτρανσφεράσες των βακτηριών και αντίστοιχα και για τους ευκαρυώτες , με ανάλογη σύγκριση αυτών . Δόθηκε η βιοχημική διάσταση της αδρανοποίησης του Χ χρωμοσώματος και κατά συνέπεια και του DNA μέσω της μεθυλίωσης . Επισημάνθηκε ακόμη ο μηχανισμός δράσης της μεθυλίωσης σχετικά με την αδρανοποίηση , τη μεταγραφή , και την αποκετυλίωση του DNA και τέλος , έγινε μια συνοπτική αναφορά σχετικά με τη μεθυλίωση του DNA και τη διαδικασία ογκογένεσης .

ΕΠΙΛΟΓΟΣ : Η μεθυλίωση είναι μια διαδικασία με τεράστιο ενδιαφέρον ενώ , πολλές πτυχές της παραμένουν ακόμη άγνωστες . Πειράματα που λαμβάνουν χώρα συνεχώς έχουν ως στόχο την πολύπλευρη ανάλυση και κατανόηση αυτού του φαινομένου .

ΒΙΒΛΙΑ

1. Αγγελοπούλου Ρ., “Εμβρυολογία”, Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ.Πασχαλίδης
2. Αγγελοπούλου Ρ., “Πειραματική Εμβρυολογία”, Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ.Πασχαλίδης
3. AlbertsB. et al, “Βασικές Αρχές Κυτταρικής Βιολογίας”, Ιατρικές εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης 2000
4. Gelehrter T. D. & Collins F. S., “Αρχές Ιατρικής Γενετικής”, Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ.Πασχαλίδης 1996
5. Zubay G. et al, “Αρχές Βιοχημείας”, Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ.Πασχαλίδης 1999

ΑΡΘΡΑ

1. Avner, P. & Heard, E.: “X-chromosome inactivation: counting, choice and initiation” Nature Reviews Genetics 2, 59-67, 2001.
2. Bannister Thomas J.O., Allshire R.C., Kourarides T.: “Selective recognition of methylated forms of histone H3” Nature 410: 120-124, 2001.
3. Boggs B.A., Cheung P., Heard E., Spector D.L., Chinult A.C., Allis C.D.: “Differentially methylated forms of histone H3 show unique association patterns with inactive human X chromosomes” Nat. Genet. 30: 73-76, 2001.
4. Li E., Beard C.B, Jaenisch R.: “Role for DNA methylation in genomic imprinting” Nature 366: 362-365, 1993.
5. Lyon M.: “The William Allan Memorial Award Address: X-chromosome in activation and the location and expression of X-linked genes”, Am. J. Hum. Gen., 42:8-16, 1988.
6. Monk M, Grant M.: “Preferential X chromosome inactivation, DNA methylation and imprinting” Development 1990.
7. Reuben M., Rueyling L.: “Germine X chromosomes of histone H3 methylation in Caernohabditis elegans” Elsevier Science USA 2002
8. Schubeler et al.: “Histone deacetylation can explain methylation repression” Mol. Cell. Biol., 20: 9103-9112, 2000.

ΥΛΙΚΟ ΑΠΟ INTERNET

1. National Library of Medicine: “Evidence that random and imprinted Xist expression is controlled by preemptive methylation” (1994)
2. Grant S.G., Chapman V.M.: “Mechanisms of X-chromosome regulation”
3. Nussbaum R.L., Ledbetter D.H.: “Fragile X Syndrome”
4. Riggs A.D. Singer-Sam J. Keith : “Biochemistry and biology of DNA methylation” (1985)
5. Davidson R.G.: “The Lyon Hypothesis

Εργασία που παρουσιάστηκε από τη φοιτήτρια Ιατρικής Αγγελίδη Αγγελική
στα πλαίσια του κατ'επιλογήν μαθήματος της Πειραματικής Εμβρυολογίας
Υπεύθυνη μαθήματος : Ρωξάνη Αγγελοπούλου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια
Εργαστήριο Ιστολογίας και Εμβρυολογίας
Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών
Για περισσότερες πληροφορίες μπορείτε να ανατρέξετε στον ιστότοπο του μαθήματος της Πειραματικής Εμβρυολογίας: http://www.med.uoa.gr/expembr/
Τελευταία αναθεώρηση : 1/5/2006