Ένα ιδιαίτερα σημαντικό, αλλά εως τώρα σχετικά παραμελημένο χαρακτηριστικό του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου είναι οι μεταβολές της κυτταρικής μεμβράνης.

Οι κυτταρικές μεμβράνες είναι γενικά ασύμμετρες και εμφανίζουν πολύ διαφορετική όψη στο εσωτερικό του κυττάρου ή του οργανιδίου απ'ό,τι στην εξωτερική επιφάνειά τους.

Είναι σημαντικός ο ρόλος της αμινοφωσφολιπιδικής τρανσλοκάσης, της φλοπάσης και σκραμπλάσης στη διατήρηση της μεμβρανικής ασυμμετρίας. Κατά την απόπτωση παρατηρείται αναίρεση της ασυμμετρίας της κυτταρικής μεμβράνης.

Η αύξηση των ιόντων Ca+2 προκαλεί αναστολή της τρανσλοκάσης και ενεργοποίηση της σκραμπλάσης, με αποτέλεσμα την εκθεση της φωσφατιδυλοσερίνης στο εξωτερικό πέταλο.

Ο ρόλος των μεμβρανικών μεταβολών στην αναγνώριση των αποπτωτικών κυττάρων. Η απώλεια της ασυμμετρίας των φωσφολιπιδίων και η έκθεση της αρνητικά φορτισμένης φωσφατιδυλοσερίνης στο εξωτερικό πέταλο έχει ως αποτέλεσμα την αναγνώριση των αποπτωτικών κυττάρων και την απομάκρυνσή τους από τα φαγοκύτταρα.

Στην αναγνώριση των αποπτωτικών κυττάρων συμβάλλει η αννεξίνη V. Ανήκει σε μία οικογένεια 18 πρωτεϊνών, τις Αννεξίνες. Προτιμά να δεσμεύεται με αρνητικά φορτισμένα φωσφολιπίδια (φωσφατιδυλοσερίνη) παρουσία ιόντων Ca+2. Παρουσιάζει ελάχιστη συγγένεια με τη φωσφατιδυλοχολίνη και τη σφιγγομυελίνη. Χρησιμοποιείται στην αναγνώριση και ποσοτικοποίηση των αποπτωτικών κυττάρων.

• Σύμπλοκο Αννεξίνη V – Φλουορεσεΐνη + Ιωδιούχο προπίδιο. Δεσμεύεται με τη φωσφατιδυλοσερίνη στην εξωτερική επιφάνεια των αποπτωτικών κυττάρων. Στα νεκρωτικά κύτταρα η Αννεξίνη V μπορεί να εισαχθεί στο εσωτερικό των κυττάρων και να προσδεθεί με τη φωσφατιδυλοσερίνη.
• Σύμπλοκο Αννεξίνη V – ALEXA 568 + BOBO 1

Περιγραφή της μεθόδου αναγνώρισης των αποπτωτικών κυττάρων με τη χρήση μικροσκοπίου

Για να γίνει εμφανής η απόπτωση στο επίπεδο του ενός μονού κυττάρου, χρησιμοποιήθηκαν τα U937 κύτταρα, των οποίων οι πυρήνες επισημαίνονται με τη χρήση DAPI. Η ουσία DAPI βάφει το DNA, δίχως να παρέχει τη δυνατότητα διάκρισης των φυσιολογικών από τα αποπτωτικά κύτταρα. Μορφολογικές μεταβολές, όπως μεμβρανικές προσεκβολές και διάσπαση του κυττάρου μπορούν να μελετηθούν με αυτήν την μέθοδο.

Για λεπτομερέστερη ανίχνευση των πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων, μέσω της ανίχνευσης της φωσφατιδυλοσερίνης στην εξωτερική στιβάδα των πλασματικών μεμβρανών των αποπτωτικών κυττάρων, χρησιμοποιήθηκε το σύμπλοκο Aννεξίνη V - Φλουορεσεΐνη.

Αυξάνοντας την ένταση του φωτός, τα φυσιολογικά κύτταρα μπορούν επίσης να παρατηρηθούν. Εύκολα διακρίνει κανείς ότι μόνο τα αποπτωτικά κύτταρα έχουν έντονα βαφεί από το σύμπλοκο Αννεξίνη V – Φλουορεσεΐνη. Εντούτοις, τα νεκρωτικά κύτταρα είναι πιθανό να έχουν και αυτά βαφεί, εξαιτίας της πρώιμης αποσύνθεσης της πλασματικής τους μεμβράνης.

Για να διακριθεί η απόπτωση από την νέκρωση είναι απαραίτητο τα κύτταρα να επαναβαφούν με Ιωδιούχο Προπίδιο (PI).

Η έκθεση της φωσφατιδυλοσερίνης ενεργοποιεί τα φαγοκύτταρα για την απομάκρυνση των αποπτωτικών κυττάρων. Υποδοχείς στην επιφάνεια των μακροφάγων :

• Ο αvβ3 υποδοχέας της Βιτρονεκτίνης
• Ο τύπου Β υποδοχέας CD36
• O τύπου Α υποδοχέας
• Ο δεσμεύων το ΑΤΡ υποδοχέας ABC-1
• O Cd14
• Ο υποδοχέας της φωσφατιδυλοσερίνης

Ο υποδοχέας της φωσφατιδυλοσερίνης είναι ο σημαντικότερος παράγοντας αναγνώρισης των αποπτωτικών κυττάρων. Είναι απαραίτητος για την έκκριση της TGFβ, η οποία είναι σε μεγάλο βαθμό υπεύθυνη για τον περιορισμό των φλεγμονώδων αντιδράσεων. Εκφράζεται σε όλα τα κύτταρα του πληθυσμού των μακροφάγων. Εκφράζεται και από τα κύτταρα των μελανωμάτων (προστασία από το ανοσοποιητικό σύστημα).

Εργασία που παρουσιάστηκε από το φοιτητή Ιατρικής Μσάουελ Παύλο
στα πλαίσια του κατ'επιλογήν μαθήματος της Πειραματικής Εμβρυολογίας
Υπεύθυνη μαθήματος : Ρωξάνη Αγγελοπούλου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια
Εργαστήριο Ιστολογίας και Εμβρυολογίας
Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών
Για περισσότερες πληροφορίες μπορείτε να ανατρέξετε στον ιστότοπο του μαθήματος της Πειραματικής Εμβρυολογίας: http://www.med.uoa.gr/expembr/
Τελευταία αναθεώρηση : 1/5/2006